关节软骨Osterix蛋白表达强度对膝关节骨性关节炎形态学变化的影响

郭凤英，张 晨，李 燕，张晋宁，杨天翔，张博文，陈德胜，Sheraz Hassan(巴基斯坦)

(1.宁夏医科大学基础医学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学临床医学院，宁夏 银川 750004；3.宁夏医科大学总医院骨科，宁夏 银川 750004)

膝关节骨性关节炎是中老年人多发的关节退行性疾病，其特征在于骨赘形成和关节软骨的丧失，软骨下骨硬化以及不同程度的滑膜组织发育不良[1-3]。在终末期，患者可出现膝关节屈曲挛缩畸形、内外翻畸形等，为常见致残原因。Osterix蛋白是维持骨代谢平衡的重要转录因子，也是调节骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cell，BMSC)向成骨细胞分化的重要信号转导途径中的关键蛋白，对预防和治疗骨性关节炎有着重要意义[4-6]。本研究探讨Osterix蛋白在关节软骨的表达强度对膝关节骨性关节炎形态学变化的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年11月1日至2020年8月31日期间在我院骨科由于膝关节骨性关节炎行全膝关节置换术治疗的患者44例，其中男性21例，女性23例；平均年龄(58.62±7.14)岁；平均体重指数(25.97±5.83)kg/m2。磨损较重的一侧为负重区(实验组)，磨损较轻的一侧为非负重区(对照组)。病例纳入标准：①符合骨关节炎诊断标准[7]者；②有显著临床症状且有手术意愿者；③术前检查未见手术禁忌证者；④无精神、意识障碍者；⑤签署知情同意书者。排除标准：①膝关节畸形、小儿麻痹、滑囊炎等影响膝关节软组织发育者；②1个月内有关节内药物注射史者。本研究已经宁夏医科大学总医院科研伦理委员会批准(伦理编号：2015-019)。

1.2 研究方法

1.2.1 采集标本：选取人工全膝关节置换术中截骨去除的股骨内、外髁，经肉眼比较后区分出负重区与非负重区，将股骨髁周围软组织剪除后，用咬骨钳将中央磨损严重部位裁切成组织块，大小约1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm。同法剪裁非负重区软骨较完整部位。将骨块置于15%乙二酸四乙酸(EDTA)液中脱钙处理，期间每3 d更换1次脱钙液，直至针刺骨组织无明显阻力感时取出，冲洗、脱水、包埋后切片处理。

1.2.2 苏木素-伊红(HE)染色：37 ℃恒温箱温育切片12 h，取出后分别采用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ及不同浓度乙醇脱蜡入水，然后在苏木素染液中染色2～3 min，冲洗3遍后置入1%盐酸乙醇中分化3 s，再次冲洗干净后伊红染色3～5 s，自然风干后用中性树脂予以封固，在显微镜下进行观察。

1.2.3 免疫组织化学染色：70 ℃烤箱温育切片12 h后，使用二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，再使用蒸馏水、PBS液各漂洗3次。随后将组织切片浸入煮沸的柠檬酸钠缓冲液中15 min，0 ℃冷却，H2O2浸泡10 min，PBS反复冲洗3次(注意不要将软骨组织冲掉)，滴加Osterix一抗(批号：ab22552；美国Abcam)，于4 ℃冰箱内孵育8 h后用PBS冲洗3次，并滴加二抗山羊抗兔IgG聚合物(批号：6927-100；美国BioVision)孵育15 min，加入DAB显色液15 s，PBS冲洗干净后苏木精复染5 min。随后采用蒸馏水冲洗2次，采用1%盐酸乙醇进行分化。再次使用蒸馏水冲洗2 min，中性树脂封固。在40倍光镜下每张切片随机选取5个视野，应用Image Pro Plus 6.0软件分析测评不同软骨细胞中Osterix蛋白的阳性表达率。

1.3 统计学方法 选用SPSS 20.0统计学软件对研究数据进行分析。计量资料以均数±标准差表示，比较采用LSD-t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 负重区与非负重区软骨大体观察 见图1。由于骨性关节炎患者的股骨内、外侧髁受力不均匀，导致两侧软骨磨损程度不一。大体观察下，负重区大量软骨丢失，标本表面粗糙，软骨下骨板暴露，色泽灰暗，甚至可见溃疡灶形成。非负重区软骨完整，标本表面光滑富有光泽，呈乳白色，未见溃疡灶。

图1 股骨远端负重区与非负重区大体观察

2.2 负重区与非负重区软骨HE染色结果 见图2。镜下观察可见负重区软骨面残缺不齐，过渡层出现裂隙，软骨细胞分布紊乱，潮线不完整，软骨下骨排列不均，有弥漫性增生；非负重区软骨表面较为平整，软骨细胞数量多，胞质完整均匀。从软骨结构、软骨细胞数量、软骨基质染色以及潮线完整程度等方面对膝关节软骨进行Mankin评分[8]，并据此将负重区分为中度磨损组(15例，7～9分)和重度磨损组(29例，10～13分)。

注：蓝色剪头所示为软骨面

2.3 负重区与非负重区软骨免疫组化染色结果 见图3。Osterix蛋白主要在成骨细胞胞浆着色，在非负重区软骨中可见呈黄褐色或棕色颗粒，负重区晚期软骨组中Osterix蛋白着色表达较少。采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件可以得到非负重区软骨组、负重区中度磨损组、负重区重度磨损组三组软骨细胞中Osterix蛋白阳性表达率，分别为(15.16±7.86)%、(11.62±5.87)%和(7.12±4.33)%，三组间两两比较结果显示，负重区重度磨损组Osterix蛋白阳性表达率小于中度磨损组，且两者均小于非负重区软骨组(均P<0.05)。

3 讨 论

膝关节骨性关节炎是骨科常见的，侵及关节软骨、滑膜的慢性疾病，随着病变的发展，患者晚期可出现膝关节疼痛、畸形以及活动障碍，致使患者的生活质量严重下降[9]。现阶段，确诊膝关节骨性关节炎的患者多已处于病变中晚期，此时关节软骨已存在严重磨损，因此现阶段临床上主要以手术作为主要的治疗手段[10]。我国作为人口大国，老龄化问题突出，随着膝关节骨性关节炎患者数量的增加，膝关节置换术的数量也逐年升高。截止到2019年，我国每年进行的膝关节置换术已超过25万例，给社会医疗、经济带来了巨大压力[11]。随着骨性关节炎发病机制相关的分子生物学研究的不断深入，通过生物学标志物早期诊断膝关节骨性关节炎的猜想越来越多，而寻找合适的靶点蛋白也逐渐成为了研究热点。

Osterix是由Nakshima等[12]首先分离出来的，是Runt相关转录因子2(Runx2)的下游靶基因，而Runx2 为细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路下游重要的靶基因之一[13]。ERK1/2活化后可激活Runx2，诱使其下游Osterix蛋白在脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸部位发生磷酸化，从而调控下游靶基因的表达，发挥促进成骨细胞分化的作用[14]。Osterix可以调控多种重要成骨基因的表达，如骨粘素、骨桥素、骨钙蛋白和Ⅰ型胶原蛋白等，对骨细胞的分化成熟和软骨细胞的修复有重要影响[15-16]，因此越来越多的人将其用于骨性关节炎的治疗及诊断。Artigas等[17]表示，Osterix蛋白可作为成骨细胞分化能力的标志，其水平下降表明成骨细胞减少或分化能力降低。

膝关节软骨的磨损退化是膝关节骨性关节炎的主要病理变化之一，也是导致关节间隙变化的原因之一。本研究通过探讨不同磨损程度的软骨与Osterix蛋白表达强度之间的关系，分析骨性关节炎中软骨退行性变与Osterix蛋白表达的相关性。结果显示，在长期的负重、受压过程中，膝关节股骨髁软骨会出现明显磨损，在负重区会出现软骨溃疡、软骨色泽及光滑度减弱等病理变化，我们猜测这些病理变化可能是受到靶点调控的结果。在通过免疫组化对不同磨损程度软骨中Osterix蛋白表达强度进行比较后，我们发现随着磨损程度的加重，Osterix蛋白在关节软骨的阳性表达强度随之减弱，二者存在负相关性，证实了在膝关节骨性关节炎软骨退变的过程中成骨细胞的分化受到了影响。有研究[18-19]也指出，Osterix与间充质干细胞成骨分化是存在双向调节的，可能正是由于膝关节软骨中Osterix蛋白的下调作用致使骨髓间充质干细胞成骨化减少，减缓了软骨细胞的修复作用，才导致关节软骨在处于因积累性磨损、外伤导致的炎性环境中快速发生退行性变。

综上所述，Osterix蛋白参与了关节软骨退行性变的过程，其在软骨细胞中的表达强度会随着软骨磨损程度的增加而减弱，可作为临床上诊断膝骨性关节炎的指标之一。