丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌对广西黎村黄鸡生长性能、肠道形态及盲肠微生物区系的影响

农斯伟 沈水宝 韦晓芳 吴克宁 袁汝喜 蓝林诚 伍校军 韦 区

（1.百色学院教育科学学院，广西百色533000；2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004）

随着社会快速发展，人们对食品的安全和质量越来越重视，据农业农村部第194 号公告：2020 年7 月1 日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。抗生素给畜禽行业带来了很多益处，但同时造成了诸多的食品安全问题。因此，寻找抗生素替代品已经成为研究热点。广西三黄鸡是两广地区的土鸡代表之一，肉质鲜皮黄薄脆、香味浓郁，是制作白切鸡或原味鸡的上好品种，但产量和养殖模式存在许多瓶颈，是需要解决的技术难点。目前市场上以快大鸡为主，但人们对土鸡的味道保持着喜爱。土鸡的养殖过程需要一定的运动量和饲养周期才可以沉淀美味和质量，生产上以放养为主，而放养过程中由于环境的不稳定影响，经常出现疾病和使用抗生素治疗导致的食品药物残留等问题。研究发现饲料中添加丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌都可改善动物肠道的微生物区系平衡，通过竞争抑制有害菌的生长繁殖，且产生的多种代谢产物具有类似抗生素的作用[1-2]。产生的抗菌物质、短链∕支链脂肪酸（SCFA∕BCFA）、维生素、甾醇类物质、芳香族化合物、胺类物质等，对机体免疫[3]和血液代谢等具有改善作用[4]。彭豫东等[5]在石门土鸡中添加枯草芽孢杆菌，发现除了提高屠宰性能外，对机体抗氧化能力和肠道形态都有一定的改善作用；杜云平等[6]分别在肉鸡和种鸡的饮水中添加1.5×109CFU∕mL的丁酸梭菌，发现肉鸡日增重增高4.62%，料肉比下降9.26%，并且可以很好地预防仔鸡肠炎。本试验旨在研究益生菌对广西黎村黄鸡的生长性能和肠道发育的影响，为广西优质土鸡的饲养提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

丁酸梭菌（由湖北蓝谷中微生物技术有限公司提供，活菌数见表1），复合菌（由北京科为博生物科技有限公司，活菌数见表1）添加量均为厂家指导剂量，并于饲料制粒过程中加入，成品料的活菌测量由北京科为博生物科技有限公司检测，以上数据为实测值。

表1 添加剂与含量

1.2 试验动物及饲粮

试验选用国家畜禽新品种（配套系）认定的广西“黎村黄鸡”，参照NRC（1994）《家禽营养标准》的营养需要的基础上，根据黎村黄鸡的品种特性、饲养管理和营养需求进行调整（见表2）。

1.3 试验设计与饲养管理

表2 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）

试验选用35 日龄，平均体重383.52 g 左右健康、精神状态良好的广西黎村黄鸡3 000 羽，按照试验要求随机分成3 个处理组，每个处理组5 个重复，每个重复200 羽。第一组：基础饲粮+丁酸梭菌（500 g∕t），第二组：基础饲粮+复合菌（丁酸梭菌+枯草芽孢杆菌）1 000 g∕t，第三组是对照组为基础饲粮，正式试验45 d。本试验采用笼养方式，饲养管理根据鸡场规定进行，人工限饲，自由饮水、温湿度控制在本阶段最适范围，每天饲喂2 次，分为上午08：00 和下午15：00，并保持鸡舍清洁卫生。试验期间每日记录料耗和死亡数，试验开始和结束时禁食12 h，每个重复抽取60羽进行称重，记录初重和末重。

1.4 生长性能测定

由于限饲，因此采食量是相对固定，耗料量以实际投饲量计，各组总耗料量一致。

平均日采食量(ADFI，g)=总投料量∕试验天数

平均日增重（ADG，g）=（末重-初重）∕试验天数

料重比（F∕G）=总耗料量∕总增重

1.5 屠宰收集样品

于试验第45 d，试验鸡禁食12 h。每个重复选1 只体重接近该重复平均体重的供试鸡进行屠宰，分别采集十二指肠、空场、回肠各2～3 cm，置于10%甲醛溶液中固定。

1.6 样品测定及方法

1.6.1 肠道形态测定

取出固定瓶中肠道组织，常规石蜡切片制作，显微镜镜检，图像在专业成像系统测量40倍视野下，测量隐窝深度、绒毛高度。

1.6.2 盲肠菌群测定

试验结束前，禁食12 h，每个重复选取1羽，进行屠宰，取盲肠内容物2～5 g放入冻存管中，迅速转入-80 ℃液氮中保存待高通检测测序，对所有盲肠样本进行总DNA 提取、PCR 扩增和Miseq 测序，数据使用专用软件进行分析。

1.7 数据整理与分析

数据使用Excel 软件先统计整理，再用SPSS 22.0软件对数据计算显著性分析，用单因素方差分析（one-way ANOVA,）和Duncan's 多重比较检验法来对比组间是否差异，结果以“平均值±标准差（X±SD）”表示。用P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著，0.05＜P＜0.10表示有差异趋势。

2 结果与分析

2.1 饲用芽孢杆菌和丁酸梭菌对黎村黄鸡生长性能的影响（见表3）

表3 饲用芽孢杆菌和丁酸梭菌对黎村黄鸡生长性能的影响

由表3 可知，由于饲养过程采取限饲，根据肉鸡日龄实行固定递增投喂量，因此耗料量一致。平均日增重方面，丁酸梭菌组和复合组分别比对照组提高7.25%和6.80%，但差异不显著（P＞0.05）；同时丁酸梭菌组和复合组的料重比与对照组相比，有降低趋势，但差异不显著（0.05＜P＜0.10）。丁酸梭菌组和复合组的死淘率与对照组相比，有降低的趋势，但差异不显著（0.05＜P＜0.10）。

2.2 饲用芽孢杆菌和丁酸梭菌对黎村黄鸡肠道形态的影响（见表4）

表4 饲用芽孢杆菌和丁酸梭菌对黎村黄鸡肠道形态的影响

由表4可知，与对照组相比，肠绒毛高度方面，复合组和丁酸梭菌组十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度有提高的趋势，但差异均不显著（0.05＜P＜0.10）；隐窝深度方面，复合组和丁酸梭菌组的空肠隐窝深度显著低于对照组（P＜0.05），且复合组和丁酸梭菌组的回肠的隐窝深度低于对照组，但差异不显著（0.05＜P＜0.10）；绒毛高度∕隐窝深度方面，复合组和丁酸梭菌组空肠和回肠显著高于对照组（P＜0.05），其他组间差异不显著（P＞0.05）。

2.3 饲用芽孢杆菌和丁酸梭菌对黎村黄鸡盲肠食糜中微生物区系的影响（见表5～表6）

表5 各组黄鸡盲肠微生物区系在门水平上的分布（门水平%）

表6 各组黄鸡盲肠微生物区系在属水平上的分布（属水平%）

由表5可知，80 d黎村黄鸡盲肠内优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门，占据90%左右。其中，丁酸梭菌组厚壁菌门的相对丰度显著高于复合组和对照组（P＜0.05），而拟杆菌门的相对丰度显著低于复合组和对照组（P＜0.05）。各组间的变形杆菌门和放线菌门差异均不显著（P＞0.05）。

从表6 可知，复合组的拟杆菌属的相对丰度最高，但与其他两组差异不显著（P＞0.05）。丁酸梭菌组的另枝菌属的相对丰度显著低于复合组和对照组（P＜0.05）。复合组的乳杆菌属的相对丰度显著低于丁酸梭菌组和对照组（P＜0.05）。对照组的梭菌属的相对丰度显著低于丁酸梭菌组和复合组（P＜0.05）。丁酸梭菌组的瘤胃球菌属的相对丰度显著高于复合组和对照组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 饲用芽孢杆菌和丁酸梭菌对黎村黄鸡生长性能的影响

研究表明，丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌的代谢产物包括多种活性酶、抗菌肽、短链脂肪酸等物质，能够提高动物对饲料的利用率，改善动物生长性能[7]；肉鸡养殖过程中发现丁酸梭菌可以提高肉鸡的生长性能[8]，但也有发现丁酸梭菌对肉鸡的平均日增重和料重比无显著影响[9]。本试验研究发现，在采食量固定的情况下，丁酸梭菌和复合菌的平均日增重有提高的趋势且料重比都有降低的趋势，但是差异不显著（P＞0.05）。这可能是由于采取限饲，提供的营养物质有限，益生菌难以发挥最大的优势。同时还发现丁酸梭菌组和复合组的生长性能无显著差异，可能是由于限饲造成枯草芽孢杆菌没能发挥功能，而丁酸梭菌发挥了主要功能；造成这一现象的机理还要进一步研究证实。丁酸梭菌和复合组的死亡率有所降低，但与对照组差异不显著（P＞0.05）。

3.2 饲用芽孢杆菌和丁酸梭菌对黎村黄鸡肠道发育的影响

肠道是动物吸收营养的主要场所，是机体内最大的消化、转运器官，同时也是一道重要的物理防御系统[10]。肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度∕隐窝深度常作为评定小肠吸收营养物质能力及肠道功能的指标。绒毛高度∕隐窝深度的比值，是小肠对养分的吸收功能的保证，比值小可反映隐窝相对较厚，绒毛上皮细胞更新率减弱，吸收养分能力相对较弱，绒毛高度∕隐窝深度比值大，可在一定程度表明吸收养分能力强。

本研究发现，丁酸梭菌组和复合组十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度均优于对照组，但是差异不显著（P＞0.05）。但在空肠的隐窝深度方面，丁酸梭菌和复合组空肠的隐窝深度显著低于对照组（P＜0.05）。徐晨希[11]发现，在肉鸡饲料中添加丁酸梭菌可显著降低十二指肠的隐窝深度。本研究发现回肠的隐窝深度也有降低的趋势，但差异不显著（P＞0.05），与上述结果相似。齐博等[12]研究发现枯草芽孢杆菌可显著提高爱拔益加(AA)肉仔鸡十二指肠的绒毛高度和绒毛高度∕隐窝深度。同样地，本试验发现添加益生菌可显著提高空肠和回肠的绒毛高度∕隐窝深度（P＜0.05）。但丁酸梭菌组和复合组间无显著差异（P＞0.05），造成这一现象可能是由于限饲引起的，肉鸡摄入量有限，具体机理还有待进一步试验验证。

3.3 饲用芽孢杆菌和丁酸梭菌对黎村黄鸡盲肠菌群分布的影响

动物肠道是一个开放的生态系统，与外界接触最为广泛，在肠道里面存在着许多微生物，这些微生物与宿主免疫防御系统之间经过长期的协同进化，与宿主共生，在维持肠道健康方面起着重要作用。研究表明，肠道中菌群的种类有500 多种，但是这些菌种大部分属于少数的几个门类[13-14]。鸡肠道中以厚壁菌门为主，其次为拟杆菌门、变形菌门和放线菌门[15]。本试验研究，黄鸡的盲肠微生物中以厚壁菌门、拟杆菌门为主，两种菌门的占比达到90%左右，其次为变形菌门和放线菌门。据研究发现厚壁菌门与拟杆菌门比值（F∕B）与动物脂类代谢有关联，F∕B 值增大，动物机体的脂肪沉积较多，这可能是由于厚壁菌门有较强的发酵能力，其产出较多的短链脂肪酸和代谢脂类的能力，有利于动物体沉积脂肪[16]。本研究发现各组的优势菌门主要是厚壁菌门和拟杆菌门，但是两个处理组的菌群F∕B 比例相差较大，复合组的第一优势菌门为拟杆菌门，而丁酸梭菌组的第一优势菌门为厚壁菌门，提示丁酸梭菌组可提高厚壁菌门相对丰度，而复合组提高拟杆菌门相对丰度，这可能是由于复合组中枯草芽孢杆菌促进拟杆菌门的繁殖，从而导致厚壁菌门的相对丰度下降。据报道，拟杆菌门是食草性动物主要的优势菌门，其功能是分解宿主难以分解的多糖（如粗纤维）、增强草食动物对纤维素的消化，促进物质转化[17]。提示饲料中添加含有枯草芽孢杆菌的益生素有利于散养鸡对粗料的消化和吸收，而单用丁酸梭菌可能不利于散养鸡对粗饲料的耐受。

在属水平上，许多研究表明动物的优势菌属主要以拟杆菌属、梭菌属、瘤胃球菌属为主，这些菌群有利于动物对营养物质吸收[18-22]。如拟杆菌属可促进动物对饲料中淀粉的消化吸收，且对肠道炎症有一定的调节功能，本研究得出各组间拟杆菌属相对含量无显著差异。

另枝菌属是一种相对较新的细菌属，主要从医学临床样品中分离出来，尽管与其他细菌类属相比，其发病率较低，而其他细菌属与菌群失调和疾病高度相关，但目前的分离方式还不能足以全部区分该属的物种；从患有阑尾炎，腹部和直肠脓肿的患者中分离出了该属的各种物种，有研究表明另枝菌属可能对某些疾病具有保护作用，包括肝纤维化、结肠炎、癌症免疫疗法和心血管疾病，但也有相反的研究证明另枝菌属在大肠癌中表现为致病性[23]。由于另枝菌属是拟杆菌属的一个较新的分支，并且拟杆菌属通常与慢性肠道炎症相关。本研究发现丁酸梭菌组的另枝菌属相对丰度显著低于其他两组，且对照组的含量最高，提示丁酸梭菌肉鸡对肠道炎症方面具有良好的保护作用，效果优于复合组。

乳杆菌属是动物肠道的有益菌群，具有维持动物机体健康和免疫调节功能，能够利用葡萄糖进行发酵并产生乳酸和乙酸等降低肠道pH，抵御外来入侵，促进其他有益菌的生长繁殖，调节肠道功能及营养的吸收利用。本研究发现丁酸梭菌组的乳杆菌属相对含量最高，显著高于复合组；提示丁酸梭菌可提高肉鸡肠道乳杆菌属的含量，而含有枯草芽孢杆菌的丁酸梭菌复合组不利于乳杆菌属的生长繁殖。

梭菌属和瘤胃球菌属可促进动物机体对饲料中纤维和碳水化合物的消化吸收。本试验添加有丁酸梭菌菌种，因此两个处理组的梭菌属含量显著高于对照组，提示添加丁酸梭菌和复合丁酸梭菌均可以提高肉鸡对营养物质的消化吸收，生长性能的平均日增重的结果进一步证实了这一结论。丁酸梭菌组的瘤胃球菌属显著高于其他两组，提示丁酸梭菌可促进瘤胃球菌属的生长繁殖，而复合丁酸梭菌组对于瘤胃球菌属的生长繁殖能力较弱。

4 结论

研究表明丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌均有提高动物的生长性能，促进动物肠道健康以及提高动物机体免疫。本试验条件下添加丁酸梭菌和复合丁酸梭菌均有提高小肠绒毛的高度、提高梭菌属、瘤胃球菌属、乳杆菌属的相对丰度，促进黄鸡对饲料中纤维和碳水化合物等营养物质的消化吸收，改善黎村黄鸡肠道健康和生长性能。添加丁酸梭菌和丁酸梭菌+芽孢杆菌组对拟杆菌、梭菌属、瘤胃球菌属、乳杆菌属等分布有一定的影响，但各组的各菌属间无规律性变化。