灌喂石榴皮瓤提取物对小鼠盲肠菌群结构及多样性的影响

黄新新 朱 静 李璇玥 马 田 李晓斌* 李佳豪 丁 峰 高慧香

（1.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆农业大学计算机与信息工程学院，新疆乌鲁木齐830052）

肠道菌群是机体的“第二大脑”，与宿主是互利共生的关系，参与宿主营养物质代谢、免疫调节、激素分泌表达及促进肠道发育等[1-3]。研究发现，肠道菌群失衡会导致消化、循环、代谢和神经等多个系统疾病的发生[4-5]。如微生物失衡导致的腹泻、肠道炎症等是诱发大肠癌和肝功能损伤的原因之一[6-9]。抗生素在杀灭病原菌的同时也会对肠道微生态环境造成破坏，长期使用使病原菌产生耐药性，从而提高宿主对病原菌的易感性，导致肠道免疫功能下降、菌群数量和丰度减少及微生物代谢产物异常，最终对宿主健康产生负面影响[10-11]。因此，调控动物肠道微生物多样性及肠道稳态对维持肠道健康意义重大。饲料中抗生素类添加剂的大量使用对食品安全以及人类健康产生重大影响。因此，抗生素替代物的筛选一直是研究的热点。鞣花酸是一种天然多酚，广泛分布于蔬菜、水果与坚果中，其具有调节肠道菌群、抗癌、抗氧化及抗炎症等生物学作用[12]。研究发现，当肠道发生炎症时，肠道中的厚壁菌门和拟杆菌门的数量减少，而促进炎症发生的有害菌数量增加[13]。沈起兵等[14]给大鼠灌喂纯度为90%的鞣花酸，结果显示鞣花酸能够显著增加大鼠肠道中拟杆菌门和拟杆菌属的丰度（P＜0.05），极显著降低变形菌门的丰度（P＜0.01），显著提高细菌的多样性（P＜0.05）；同时鞣花酸可以促进肠道中有益菌的生长和降低厚壁菌门∕拟杆菌门的比值，从而调控肠道微生态的稳定[15]。因此，本试验以小鼠为研究对象，通过给小鼠灌喂石榴皮瓤提取物，探究石榴皮瓤中鞣花酸对小鼠肠道菌群的影响，为进一步深入探究鞣花酸对肠道菌群调控的机制及其生物学作用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验选择平均日龄50 d、体重相近（37.31±5.57）g、健康良好的SPF级雄性昆明小鼠30只，购自新疆医科大学。

1.2 石榴皮瓤中鞣花酸的提取及测定

1.2.1 提取方法

在市场上购买新疆和田皮亚曼新鲜石榴，石榴去除籽实后剩余的皮瓤晾干，用于提取。石榴皮瓤中鞣花酸提取方法参考陈鹏等[16]提取方法。

1.2.2 测定方法及鞣花酸含量

鞣花酸测定的色谱分析条件：色谱柱为C18（Welch Ultimate AQ-C18，4.6×250 mm，5 μm）；流动相的配制：分别量取甲醇∶水∶冰乙酸铵50∶49.85∶0.15（V∕V∕V）的比例混合，用0.45 μm滤膜抽滤，超声脱气30 min；检测波长：254 nm，柱温：35 ℃；进样量：20 μL。鞣花酸的平均含量为（27.16±5.26）mg∕g（风干重）。

1.3 试验设计

将试验小鼠，随机分为2组，每组15只，分别为对照组和试验组。在相同基础日粮条件下试验组小鼠灌喂1.5 g∕（d·只）石榴皮瓤粗提物[即鞣花酸的灌喂量为40.74 mg∕（d·只）]，将1.5 g 提取物溶解于2 mL蒸馏水中，分别在每天10：00 和18：00 分两次灌喂，每次灌喂1 mL，对照组每次灌喂相应体积的蒸馏水，进行为期21 d的灌喂试验。第22 d早晨空腹断颈处死全部小鼠，采集小鼠盲肠内容物，-70 ℃冷冻保存，待测。日粮组成及营养水平见表1。

1.4 样品采集与指标测定

在第22 d，将所有小鼠断颈处死，采集小鼠盲肠内容物，同一组3 只小鼠的样品合为1 个样品，用无RNA冻存管分装，-70 ℃冷冻保存，即每个组最终5个样品，用于分析盲肠菌群结构和多样性。

1.5 样品测定

总DNA 提取、PCR 扩增及Illumina HiSeq 测序及结果分析均委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司协助完成。

表1 日粮组成及营养水平（以风干物质计，%）

1.6 数据处理

菌群丰度数据均以“平均数±标准误（Mean±SE）”表示，使用SPSS 19.0软件进行独立样本T检验分析。

2 结果与分析

2.1 石榴皮瓤提取物对小鼠盲肠门水平菌群丰度的影响（见表2）

表2 门水平小鼠盲肠菌群丰度

由表2可知，小鼠盲肠内容物中门水平丰度较高的物种有厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、脱铁杆菌门、软壁菌门。其中80%以上的是厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门。而石榴皮瓤提取物对拟杆菌门和放线菌门丰度有显著影响（P＜0.05），拟杆菌门试验组比对照组显著提高了65.00%（P＜0.05）；而放线菌门试验组比对照组降低了49.35%（P＜0.05）。其他菌门试验组与对照组之间差异不显著（P＞0.05）。

2.2 石榴皮瓤提取物对小鼠盲肠科水平菌群丰度的影响（见表3）

表3 科水平小鼠盲肠菌群丰度

由表3可知，小鼠盲肠内容物中科水平丰度较高的物种有乳杆菌科、肠球菌科、毛螺菌科、Muribacula⁃ceae、脱疏弧菌科、理研菌科、Eggerthellaceae、韦荣球菌科及瘤胃菌科。试验组与对照组相比，石榴皮瓤提取物能够显著增加小鼠肠道中理研菌科丰度（P＜0.05）。其他菌科试验组与对照组之间差异不显著（P＞0.05）。但毛螺菌科试验组比对照组减少了41.65%（P＞0.05），而Muribaculaceae试验组比对照组有所增加。

2.3 石榴皮瓤提取物对小鼠盲肠属水平菌群丰度的影响（见表4）

表4 属水平小鼠盲肠菌群丰度

由表4可知，小鼠盲肠内容物中属水平丰度的较高的物种有乳杆菌属、肠球菌属、脱硫弧菌属、单胞生糖菌属、肠杆菌属、另枝菌属、Faecalitalea、拟杆菌属、分节丝状菌以及臭杆菌。试验组与对照组相比，石榴皮瓤提取物能够显著增加拟杆菌属（P＜0.05），试验组比对照组增加了96.84%（P＜0.05）。属水平上其他物种，试验组与对照组差异均不显著（P＞0.05）。但肠杆菌属试验组比对照组有所减少。

2.4 Alpha diversity分析

Alpha 多样性分析表明，Chao1、ACE、Shannon 数值越大，Simpson指数值越小，说明菌群丰富度和多样性越高。由表5可知，对照组与试验组小鼠肠道中菌群丰度和多样性差异不显著（P＞0.05），但试验组小鼠在灌喂石榴皮瓤提取物后肠道中Chao1、ACE和Shan⁃non指数相比对照组有所增加（P＞0.05）。

表5 小鼠盲肠菌群Alpha多样性

2.5 Beta diversity分析

2.5.1 LEfSe分析

LEfSe分析能够在组与组之间寻找有统计学差异的物种。由图1 LDA分布柱状图可知，小鼠盲肠内容物中，对照组与试验组在各类水平上有差异性物种共有13种。试验组在各类水平上的显著优势物种有10种，分别为拟杆菌门、拟杆菌纲、拟杆菌科，Muribacu⁃laceae 科、瘤胃球菌科、另枝菌属、Marinifilaceae 科、Odoribacter 属、巴氏链球菌种、生黄瘤胃球菌种。对照组优势物种有3 种，分别为根瘤菌科、Parvibacter属、Streptocoocus_azizii 种。试验组差异显著的物种种类比对照组丰富，这可能与小鼠灌喂石榴皮瓤提取物对肠道菌群的影响有关。

图1 LDA分布

2.5.2 主成分分析

由图2 可知小鼠盲肠主成分（PCA）分析结果，图中主成分1（PC1）为第1主坐标，对检测到总微生物的代表性贡献率为42.99%，主成分2（PC2）为第2 主坐标，对检测到总微生物的代表性贡献率为35.63%。试验组有两种菌与对照组较为接近，而试验组的其他三种菌与对照组区分开来。

图2 主成分分析结果

2.5.3 T-test

为了寻找各菌群分类水平下，组间的差异物种，做组间的T-test 检验，找出差异显著（P＜0.05）的物种。由图3 可知，左图为组间差异物种丰度展示，图中每个条形分别表示在分组间丰度差异显著的物种在每个组中的均值。右图为组间差异置信度展示，图中每个圈的最左端点表示均值差的95%置信区间下限，圆圈的最右端点表示均值差95%置信区间上限。圆圈的圆心代表的是均值的差。圆圈颜色所代表的组为均值高的组。展示结果的最右端是对应差异物种的组间显著性检验P值。该结果为属水平，试验组另枝菌属（Alistipes）的丰度显著高于对照组。

2.5.4 MetaStat分析

MetaStat分析能够找出不同分组间显著差异的物种，在门、纲、目、科、属、种6 个层级分别做组间物种差异显著性分析，得到不同层级。由图4可知，Candi⁃datus_Stoquefichus、Streptocoocus、unidentified_Clostridi⁃ales 和臭杆菌属（Odoribacter）4 个物种试验组与对照组差异显著（P＜0.05）。而另枝菌属（Alistipes）试验组与对照组差异极显著（P＜0.01）。

3 讨论

图3 T-test组间物种差异分析

图4 MetaStat分析

肠道微生物包括真菌、古菌、细菌及原虫等，与肠道内容物（消化物、消化液及消化酶）、肠道组织共同构建成一个复杂而稳衡的内环境，维持肠道发育与肠道健康，对动物的生长发育意义重大[17]。相反，肠道微生态破坏会导致机体代谢性疾病、自身免疫病、炎症反应等多种疾病的并发症[18]。影响和改变肠道菌群组成及多样性的因素较多，包括年龄、性别及生理状态等内部因素[19-22]，也包括影响较大的日粮结构的改变、饲料添加剂的饲喂(如抗生素、益生菌、多酚等)及饲养管理环境等外部因素[23-26]。

Bialonska 等[27]研究表明，石榴副产物中的多酚可以促进人体肠道中双歧杆菌、乳杆菌属及产生短链脂肪酸类菌群的数量。本试验结果显示，给小鼠灌喂石榴皮瓤提取物，在门水平上，可显著增加拟杆菌门的丰度（P＜0.05），降低厚壁菌门∕拟杆菌门的比值；显著降低了放线菌门的丰度（P＜0.05）。在科水平上，可显著增加理研菌科丰度（P＜0.05）和提高Muribaculaceae丰度（P＞0.05）；降低了毛螺菌科的丰度，试验组比对照组减少了41.65%（P＞0.05）。在属水平，可显著增加拟杆菌属的丰度（P＜0.05），而降低肠杆菌属的丰度（P＞0.05）。Wang等[28]研究结果显示，给高胆固醇饮食的大鼠日粮中补喂薏仁多酚，可减少与体内脂代谢平衡相关的丹毒丝菌科、梭状芽孢杆菌科以及毛螺菌科中Blautialuti 属这3 种菌的丰度；同时能够缓解高胆固醇饮食诱导的代谢紊乱。沈起兵等[14]给大鼠灌喂纯度90%的鞣花酸，能够显著增加大鼠肠道中拟杆菌门和拟杆菌属的丰度，而极显著降低变形菌门的丰度。本试验研究结果与Wang 等[28]和沈起兵等[14]相一致，说明多酚类物质可以改变动物肠道内微生物的种类和数量。本试验小鼠盲肠菌群的改变，与石榴皮瓤提取物中的鞣花酸有关。由于鞣花酸生物学作用的发挥主要依赖于肠道微生物将鞣花酸代谢为尿石素，在代谢过程鞣花酸扮演了被代谢与调节的作用，从而改变了肠道微生物，促进相关微生物的繁殖[29]。同时，鞣花酸的抗炎和抗菌的生物活性能够抑制与肠道炎症、腹泻有关的毛螺菌科和肠杆菌属的生长，减少致病菌带来的危害[30-31]。因此，这可能就是鞣花酸调控肠道菌群种类和数量的原因。

肠道中菌群多样性一方面反映出菌群的种类和数量的多少，另一方面反映出菌群对不同胃肠道环境的适应性。菌群在肠道适应性越强，其菌群的多样性越明显，对肠道健康和宿主健康更有益[32]。研究表明，膳食和果蔬中含有的多酚类物质可被肠道菌群代谢分解进一步提高它们的生物活性和利用率，从而改善宿主的肠道健康[33]。沈起兵等[14]研究结果显示鞣花酸能够改变肠道菌群多样性，随着试验期的进行，试验第28 d的大鼠肠道菌群多样性指数Shannon、Chao1和ACE 均显著或极显著（P＜0.05 或P＜0.01）的高于灌喂第0 d。本试验结果显示，给小鼠灌喂石榴皮瓤提取物对小鼠肠道菌群多样性无显著影响，但提高了Shannon、chao1 和ACE 的值；此外Beta diversity 分析中使用LEfSe、主成分分析、T-test 和MetaStat 分析发现，石榴皮瓤提取物能够增加试验组小鼠盲肠差异物种的数量，丰富了细菌的结构，与上述研究结果相似。因此，菌群多样性更进一步的说明鞣花酸的补喂能够改变肠道菌群的种类与数量，增加细菌的多样性和丰富度。鞣花酸作为一类多酚物质，已被证实具有调节肠道菌群的作用[14]。此外，由于鞣花酸在肠道中作为代谢底物被肠道菌群分解产生尿石素，而尿石素也具有调节肠道菌群的作用[29]。可能是本试验小鼠盲肠菌群结构和多样性改变的原因。

抗生素等药物添加剂产生的危害引起了社会的广泛重视。在2020年饲料端全面“禁抗”，养殖端“减抗、限抗”行业背景下，绿色无残留安全的“替抗”产品成为当前急需解决的问题。鞣花酸作为一类植物多酚类物质，其生物学作用已被证实。本试验的目的不仅是为了深层次研究鞣花酸调控肠道菌群的生物学作用，同时也为鞣花酸可作为当前畜牧生产中“替抗”产品的开发提供理论依据。

4 结论

在本试验条件下，给小鼠灌喂石榴皮瓤提取物可显著增加小鼠肠道中拟杆菌门、理研菌科、拟杆菌属的丰度，降低了厚壁菌门∕拟杆菌门比值；显著降低了放线菌门；使小鼠肠道中的菌群多样性呈上升趋势。给小鼠灌喂石榴皮瓤提取物鞣花酸可以改善和调控小鼠肠道菌群的稳态，优化肠道菌群的结构。初步揭示了鞣花酸具有调节肠道菌群的生物学作用，而鞣花酸在肠道中如何发挥其生物作用和是否适用于大型家畜有待进一步研究。