番石榴叶提取物调节白色脂肪组织棕色化作用机制研究

代 培，许光远，刘铜华，高 明，苏 通，周静鑫，乔 羽，郭翔宇

(1.北京中医药大学东方医院，北京 100078；2.首都医科大学附属复兴医院，北京 100038；3.北京中医药大学，北京 100029；4．日本武库川女子大学药学部，日本 兵库 6638179；5.北京中医药大学东直门医院通州院区，北京 101121)

随着人们生活方式的改变，糖尿病患病率逐年升高[1]。现代医学认为超重和肥胖是糖尿病的独立危险因素。中医学对肥胖导致糖尿病的观点早在《素问·奇病论》中就有明确提出：“脾瘅为肥美之人所发也，此人必数食甘美而多肥也，肥者令人热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”。“治之以兰，除陈气也”是糖尿病治疗的原则。番石榴叶(Guava leaf)具有燥湿健脾、清热解毒的功效，是中医用来治疗糖尿病的常用药材。本研究中，通过细胞实验，观察番石榴叶提取物对db/db小鼠成肌细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(Peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)、Ⅲ型纤连蛋白域包含蛋白5(Type Ⅲ fibronectin domain contains protein 5，FNDC5)以及脂肪组织SVF细胞PR结构域16(PR domain-containing 16，Prdm16)蛋白表达的影响，进一步揭示番石榴叶提取物调节脂质代谢的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究动物：购买6周龄雄性SPF级db/db(品系为C57BLKS)小鼠24只、同龄C57BL/6J正常组小鼠6只，饲养于北京中医药大学SPF级实验动物中心。

1.1.2 主要仪器与试剂：血糖仪(Bayer公司)，DMEM培养基(Lot:31331093，Thermo Fisher公司)，胎牛血清(Lot：10100147，Gibco-BRL公司)，胰蛋白酶(Lot：T2600000，Sigma公司)，胶原酶(Lot：C6079，Sigma公司)，Ficoll400(Lot:20190530，Pharmacia公司)，结蛋白单克隆Desmin抗体(批号 ZA-0610，中杉生物公司)，MTT Assay试剂盒(Lot：211091，Amerison公司)，CD31单克隆抗体(Lot：77699S，CST公司)，CD34单克隆抗体(Lot：3569，CST公司)，Anti-PGC-1α抗体(Lot：ab191838，Abcam公司)，重组Anti-FNDC5抗体(Lot：ab174833，Abcam公司)，Anti-Prdm16抗体(Lot：ab106410，Abcam公司)，Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(Lot：7074，CST公司)，猴抗山羊FITC二抗(Lot：F4891，Sigma公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验药物制备：番石榴叶提取物由北京中医药大学药学院制备。提取工艺具体操作如下：番石榴叶片粉碎后取粗粉1.1 kg，用3倍量乙酸乙酯在25 ℃、超声50 MHz条件下提取10 min，重复共7次，过滤取药渣，用5倍量的乙醇超声提取15 min，重复4次，留取过滤液， 浓缩得浸膏。浸膏与4倍量水制成混悬液，6000 r/min条件下离心15 min得上清液1；乙醇提取剩余药渣用5倍量水超声提取40 min，重复2次，将2次过滤所得滤液合并，在6000 r/min的条件下离心15 min得上清液2，合并上清液1、2，采用改良明胶法去除鞣质，再次过滤后滤液上聚酰胺 (100～200目) 柱，依次用水洗脱，洗脱液减压浓缩，制得水浸膏64.07 g。

1.2.2 动物分组及给药：适应性喂养2周后，禁食12 h，断尾后用血糖仪检测空腹血糖。将空腹血糖≥7.0 mmol/L的db/db小鼠纳入实验，随机分为模型组和番石榴叶提取物高剂量组、番石榴叶提取物中剂量组、番石榴叶提取物低剂量组，四组各6只，同龄C57BL/6J小鼠6只为正常组。用体表面积法计算每日小鼠给药量，番石榴叶提取物按高(14 mg/kg)、番石榴叶提取物中剂量(7 mg/kg)、番石榴叶提取物低剂量(3.5 mg/kg)，每日灌胃1次，正常组和模型组灌予等体积蒸馏水，连续4周。实验期间，小鼠均以普通饲料喂养，且除实验要求空腹禁食外，均自由进食、饮水。

1.2.3 观察指标：观察小鼠一般情况、每2周检测空腹血糖及体重，处死、取材及检测生化指标。实验末即第29天空腹脱臼处死所有小鼠，眼眶取血，检测空腹血糖、甘油三酯(Triglycerides，TG)、总胆固醇(Total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)。

1.2.4 细胞培养：①原代成肌细胞培养及纯化：空腹脱臼处死db/db小鼠、C57BL/6J小鼠后，取后腿腓肠肌组织剪碎，0.125%胰酶消化分离细胞，离心后用配置好的培养基(含15%胎牛血清的DMEM-F12培养基)制备细胞悬液，并按2×105个/ml的密度接种于培养瓶中，在显微镜下观察细胞生长情况。将制备好的Ficoll400梯度液用D-Hanks液配制成200 g/L，进行稀释配制成梯度离心液。取原代培养第2天的细胞在培养瓶中培养。②原代脂肪组织SVF细胞培养、接种和传代：空腹脱臼处死db/db小鼠和C57BL/6J小鼠后，取皮下脂肪组织剪碎，用1%BSA和0.1% N型胶原酶消化分离细胞，间断振荡后终止消化，离心后重悬计数，移入含有培养基的培养瓶中，置于CO2培养箱培养，当镜下观察到细胞生长约70%～80%时即会传代。

1.2.5 细胞实验分组：取对数生长期的成肌细胞、第3代脂肪组织SVF细胞，以1×105个/ml密度接种至96孔板。对细胞进行实验分组，具体分组情况如下：正常对照组、模型组、番石榴叶提取物高剂量组、番石榴叶提取物中剂量组、番石榴叶提取物低剂量组(终浓度分别为10、50、100 μg/ml)。

1.2.6 蛋白水平检测：各组细胞连续培养48 h，收集细胞并提取蛋白。Western blot法检测各组成肌细胞PGC-1α、FNDC5蛋白表达；并检测各组脂肪组织SVF细胞Prdm16蛋白表达。

2 结 果

2.1 各组小鼠体重及空腹血糖比较 第4周时，和正常组相比，模型组小鼠体重、空腹血糖均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，番石榴叶提取物高剂量组小鼠体重及血糖均低，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 各组小鼠血脂情况比较 和正常组相比，模型组小鼠血清TC、TG和LDL含量明显升高，HDL含量明显降低，组间差异有统计学意义(均P<0.05)。与模型组比较，番石榴叶提取物各剂量组小鼠TC含量无明显改善，TG含量降低，组间差异有统计学意义(P<0.05)；番石榴叶提取物中剂量组、番石榴叶提取物低剂量组HDL明显升高，组间差异有统计学意义(P<0.05)；番石榴叶提取物高剂量组LDL水平降低，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表1 各组小鼠体重及空腹血糖比较

表2 各组小鼠血脂情况比较(mmol/L)

2.3 各组成肌细胞PGC-1α、FNDC5蛋白以及脂肪组织SVF细胞Prdm16蛋白表达比较 与正常组小鼠成肌细胞比较，模型组小鼠成肌细胞的PGC-1α、FNDC5蛋白及脂肪组织SVF细胞Prdm16蛋白表达均低，组间差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组小鼠成肌细胞比较，番石榴叶提取物高剂量组小鼠成肌细胞的PGC-1α、FNDC5蛋白及脂肪组织的SVF细胞Prdm16蛋白表达均高，组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表3(图1、2)。

表3 各组成肌细胞PGC-1α、FNDC5蛋白及脂肪组织SVF细胞Prdm16蛋白表达比较

NC：正常组；DM：模型组；FSL-H：番石榴叶提取

NC：正常组；DM：模型组；FSL-H：番石榴叶提取

3 讨 论

超重和肥胖是2型糖尿病的主要危险因素之一[2]。肥胖多由于脂肪组织分布不均导致，哺乳动物的脂肪组织主要有白色脂肪组织(White adipose tissue，WAT)和棕色脂肪组织(Brown adipose tissue，BAT)，WAT具有机械保护、隔热和储能的作用，BAT主要调节产热[3-5]，肥胖的特征在于WAT质量的增加[6-7]。PGC-1α、FNDC5、Irisin等代谢因子，能促进线粒体生成、调节脂质代谢、增加能量代谢，从而减少代谢性疾病的发病率[8]。PGC-1α主要存在于线粒体含量丰富的组织，如骨骼肌、BAT，在WAT棕色化中发挥了重要作用[9-10]。Prdm16是BAT特异性辅助因子，与WAT细胞相比，该辅助因子在BAT细胞中高度表达，对于BAT细胞的形成至关重要[11]，同时，Prdm16也促进了WAT棕色化[12]，Prdm16通过与C末端结合蛋白相互作用来抑制经典的WAT细胞基因，并刺激WAT中参与产热作用的PGC-1α、解偶联蛋白1(Uncouple protein 1，UCP1)的转录[13-14]。

番石榴叶具有燥湿健脾、清热解毒的功效。多项实验证明，番石榴叶提取物具有降低血糖、体重、血脂等作用[15-17]。在前期动物实验中，我们已经证实了番石榴叶提取物可通过调节骨骼肌的AMPK-PGC-1α-FNDC5信号通路转导，诱导白色脂肪组织棕色化减轻体重[18]。本研究中，我们观察了番石榴叶提取物对db/db小鼠成肌细胞PGC-1α、FNDC5，以及脂肪组织SVF细胞Prdm16蛋白表达的影响。结果发现，在动物实验中，番石榴叶提取物高剂量组能明显降低糖尿病小鼠的体重、血糖、LDL水平，在细胞实验中，番石榴叶提取物能显著提高小鼠成肌细胞PGC-1α、FNDC5以及脂肪组织SVF细胞Prdm16蛋白表达。番石榴叶提取物分别上调成肌细胞PGC-1α、FNDC5和脂肪组织SVF细胞Prdm16蛋白水平，说明番石榴叶提取物可以通过促进白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化，提高棕色脂肪水平，从而通过增加机体的能量代谢来调节脂质代谢。

番石榴叶提取物促进白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化的实验结果充实了“治之以兰，除陈气也”的理论基础，为临床汇总燥湿健脾类中药降低血糖、体重提供了新思路。