清热化痰合剂质量标准的研究

亓淑芬，张乐青*，丁 健，葛朝晖

（1.阳谷县人民医院，山东 阳谷 252300；2.阳谷县市场监管稽查大队，山东 阳谷 252300；3.临沂大学，山东临沂 252000）

清热化痰合剂由麻黄、杏仁、浙贝母、金银花、生甘草等11味中药组成，是我院传统经验方剂，是经过长期临床实践，逐步整理完善而形成的有效方剂，用于治疗流行性感冒及一般性感冒，症见发热、咳嗽、流涕、咽喉肿痛。此方以清热解毒、化痰止咳为治则，其中金银花、浙贝母和麻黄为君药。麻黄碱作为麻黄的主要有效成分，有镇咳平喘、解热发汗、抗病原微生物等作用[1]；浙贝母具有散结消痛、清热化痰等效用[2]；金银花具有清热解毒等功效，适用于治疗热毒痛痒、温病发热、胀满下疾等疾病[3]。为了控制本医院制剂的质量，参照相关文献，本文采用薄层色谱法（TLC）对方中的麻黄和浙贝母进行定性鉴别，以高效液相色谱法（HPLC）对金银花中的绿原酸进行含量测定，并且经验证，制定的方法准确可靠，能有效控制清热化痰合剂的质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；FA1204型天平（上海菁海仪器有限公司）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂分厂）。

1.2 试药

麻黄碱对照品（批号：171241-201007），贝母素甲对照品（批号：110750-200609），绿原酸对照品（批号：110753-201716），甘草对照药材（批号：120904-201318），均由中国食品药品检定研究院提供。清热化痰合剂（批号分别为20190516，20190518，20190520，阳谷县人民医院自制）。乙腈，甲醇，醋酸均为色谱纯，水为实验室二次蒸馏水；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 麻黄鉴别 取本品30 ml，加浓氨1 ml，用乙醚萃取两次，每次30 ml，合并两次乙醚液，蒸干，残渣加入二氯甲烷1 ml使其溶解，作为供试品溶液。按清热化痰合剂处方比例及制剂工艺，制备缺少麻黄的阴性样品溶液，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。另取麻黄碱对照品适量，加入二氯甲烷，制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点在同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷:甲醇:浓氨（4:1:0.1）为展开剂，展开，取出，晾干。喷茚三酮试液后，105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，结果见图1。

图1 麻黄TLC鉴别

2.1.2 浙贝母鉴别 取本品30 ml，加浓氨1 ml，用二氯甲烷萃取两次，每次30 ml，合并两次二氯甲烷液，蒸干，残渣加二氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。按清热化痰合剂处方比例及制剂工艺，制备缺少浙贝母的阴性样品溶液，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。另取贝母素甲对照品适量，加二氯甲烷制成每1 ml含1 mg贝母素甲的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2015年版四部通则0502）试验，分别吸取阴性对照溶液、对照品溶液、供试品溶液各3 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨（17:2:1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾溶液至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品溶液相应位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，结果见图2。

图2 浙贝母TLC鉴别

2.2 绿原酸含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h的绿原酸对照品25 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀释置刻度，摇匀，作为对照品贮备液。再精密量取对照品贮备液1 ml至10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为100 μg/ml对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 精密量取清热化痰合剂2 ml，置入200 ml量瓶，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按清热化痰合剂处方比例及制剂工艺，制备缺少金银花的阴性样品溶液，并照上述供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

2.2.4 色谱条件 色谱柱：Unitary C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1 %醋酸溶液-乙腈，按表1进行梯度洗脱；流速：1 ml/min；进样量：10 μl；柱温：30 ℃；检测波长为327 nm。

表1 梯度洗脱时间表

2.2.5 专属性试验 分别取对照品溶液，供试品溶液及阴性样品溶液，按2.2.4项色谱条件测定。结果表明，供试品溶液的色谱图中，在与对照品溶液的色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且分离度好，而阴性样品溶液在此保留时间处无干扰，即本方法的专属性好。详见图3～5。

图3 阴性样品溶液HPLC图谱

图4 绿原酸对照品溶液HPLC图谱

图5 供试品溶液HPLC图谱

2.2.6 线性关系考察 取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度分别为20，40，60，80，100 g/ml的对照品溶液，按2.2.4项色谱条件测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为y=28.106x-93.03（r=0.9980，n=5）。结果表明绿原酸在20～100 μg/ml范围内线性关系良好。

2.2.7 仪器精密度试验 取绿原酸对照品溶液（浓度为100 μg/ml），连续进样6次，每次精密吸取10 μl进样，测得绿原酸峰面积的RSD为0.58 %。结果表明仪器精密度良好。

2.2.8 溶液稳定性试验 取2.2.2项下供试品溶液，分别于配制后在室温下放置0，2，4，8，12，24 h时，按2.2.4项色谱条件测定，测得绿原酸峰面积的RSD为0.83 %。结果表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 精密量取同批号的清热化痰合剂6份，每份各2 ml，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.4项下色谱条件测定。结果绿原酸的平均含量为6.115 mg/ml，RSD为1.38 %，结果表明方法重复性良好。

2.2.10 加样回收试验 精密量取6份已知含量的样品（绿原酸含量为6.115 mg/ml）溶液，每份1 ml，分别精密加入1 ml绿原酸对照品溶液（3.0061 mg/ml），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.4项下色谱条件进行测定，结果见表2。绿原酸平均回收率为98.06 %，RSD为1.16 %。

表2 回收率试验结果

2.2.11 样品的含量测定 分别取3批清热化痰合剂（批号分别为20190516，20190518，20190520），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.4项下色谱条件测定，3批样品中绿原酸的含量分别为6.1151，6.106，6.139 mg/ml。

3 讨论

麻黄的TLC鉴别中，分别采用正丁醇:冰醋酸:水（8:2:1）[4]、环己烷:三氯甲烷:甲醇（1:3:1）[5]、三氯甲烷:甲醇:浓氨试液（4:1:0.1）[6]为展开剂。结果以二氯甲烷:甲醇:浓氨试液（4:1:0.1）为展开剂时主斑点显色更加清晰，各斑点间的分离效果好。

在浙贝母的TLC鉴别中，分别选用乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（17:2:1）[7]、乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（17:2:0.5）[8]、乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液-水（25:1:1:0.1）[9]为展开剂。结果以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液（17:2:1）为展开剂时主斑点显色清晰，在与对照品斑点相应的位置上，显相同颜色的的斑点，阴性对照无干扰。

甘草作为此方剂中的使药，用量较少，曾对甘草进行TLC鉴别。参考《中国药典》（2015年版）甘草项下鉴别方法及有关文献资料，制备供试品溶液、甘草对照药材溶液、甘草阴性对照溶液，分别选用乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15:1:1:2）[10]、乙酸乙酯-甲酸-水（8:3:1）[11]为展开剂，甘草阴性对照溶液无明显干扰，但供试品溶液斑点不清晰，试验结果不理想，重现性差。故未将此方法收入标准。

绿原酸含量测定中在进行流动相选择时，分别考察了乙腈-水-冰醋酸（15:85:0.2），乙腈-0.4 %磷酸溶液（12:88）系统，分离效果均不佳，色谱峰不能完全分离。改用0.1 %醋酸溶液-乙腈为流动相，并采用梯度洗脱，色谱峰峰形较好，出峰时间较快，分离度好于其他条件且阴性无干扰。