不同产地车前草HPLC指纹图谱及化学模式识别研究

（湖南省郴州市第一人民医院药剂科，湖南 郴州 423000）

车前草是车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd.的干燥全草，具有清热利尿通淋，祛痰，凉血，解毒的功效，用于治疗热淋涩痛，水肿尿少，暑湿泄泻，痰热咳嗽，吐血衄血，痈肿疮毒等证[1]。车前草有广泛的临床用途、药源丰富、廉价易得，含黄酮类、苯乙醇苷类、环烯醚萜类、三萜类等成分[2-3]，在抗炎、抗肿瘤、抗氧化等方面显示出潜在的药用价值[4-6]。其质量研究报道多为高效液相色谱（HPLC）法测定其若干活性成分的含量[7-12]，未见有相关指纹图谱研究的文献报道。本研究以江西、四川、江苏、广西、安徽5个产地16批车前草为研究对象，建立其指纹图谱，通过相似度评价、聚类分析和主成分分析对其质量进行评价，旨在为车前草的合理利用和质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱仪，包括HPG-3x00A二元泵、Split-Loop自动进样器、Chromeleon 7色谱工作站、PDA-3000二极管阵列检测器（美国Thermo Fisher Scientific公司）；SP3-100AL超声波清洗机（上海泗裴电子科技有限公司）；Mettler Toledo Xs205 分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；QJ-02A 型粉碎机（上海兆申科技有限公司）。

1.2 材料

大车前苷，毛蕊花糖苷，异毛蕊花糖苷，木樨草苷，木犀草素，芹菜素对照品（中国食品药品检定研究院，纯度均≥98.0 %）；收集的16批样品信息见表1。16批车前草药材经贵州医科大学药学院巩仔鹏教授鉴定，均为车前科植物车前 Plantago asiatica L.或平车前Plantago depressa Willd.的干燥全草。甲醇、乙腈为色谱纯（美国 Tedia 公司），其他试剂均为分析纯，水为纯净水。

表1 车前草药材来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1 %甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～8 min，10 %A；8～20 min，10 %A→15 %A；20～28 min，15 %A→25 % A；28～40 min，25 %A→40 %A；40～52 min，40 %A→55 %A；52～60 min，55 %A→10 %A；65～70 min，8 %A）；流速：1.0 ml/min；检测波长：330 nm；柱温：25 ℃；进样量：10 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取车前草药材样品粉末2.0 g，置于具塞锥形瓶中，加70 %甲醇30 ml，称定重量，超声提取（功率：250 W，频率：40 kHz） 30 min，放冷，再称定重量，用70 %甲醇补足减失的重量，摇匀，经 0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取大车前苷、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷、木犀草苷、木犀草素、芹菜素对照品适量，加70 %甲醇制成每1 ml分别含352.1，65.32，42.47，25.14，17.98 μg的混合对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取2.2项下供试品（样品编号：S1）溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定 6次。以9号峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间的RSD为0.12 %～0.38 %，相对峰面积的RSD为0.74 %～1.91 %，均小于 2.0 %（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取2.2项下供试品（编号：S1）溶液适量，分别于室温下放置 0，6，12，20，30 h 时，按2.1项下色谱条件进样测定。以9号峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间的RSD为0.28 %～0.81 %，相对峰面积的RSD为0.98 %～1.81 %，均小于2.0 %（n=5），表明供试品溶液于室温下放置30 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取车前草药材样品（编号：S1）适量，共6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定。以9号峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果19个共有峰相对保留时间的RSD为0.17 %～0.69 %，相对峰面积的RSD为0.74%～1.85 %，均小于2.0 %（n=6），表明本方法重复性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的建立及分析

2.4.1 HPLC指纹图谱测定及相似度分析 取16批药材样品（编号：S1～S16），按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。将16批药材的HPLC色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），以 S1样品图谱为参考图谱，时间窗宽度设为 0.1 s，中位数法生成对照指纹图谱，其叠加指纹图谱和对照指纹图谱详见图1、图2。对16批药材样品（编号：S1～S16）进行相似度分析，结果表明，10批药材样品相似度在0.854～0.957之间，表明各批药材主要化学成分较为一致。

图1 16批药材样品的HPLC叠加指纹图谱

图2 16批药材样品的HPLC对照指纹图谱

2.4.2 共有峰指认 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年A版），对16批样品的HPLC图谱进行比较分析，16批样品共有19个共有峰，其峰面积占色谱峰总面积的90 %以上，提示该方法可用于评价药材的整体质量。在19个共有峰中，通过与对照品图谱对比，并结合各峰的紫外吸收光谱，指认出4号峰为大车前苷、7号峰为毛蕊花糖苷、9号峰为异毛蕊花糖苷、11号峰为木樨草苷、14号峰为木犀草素、17号峰为芹菜素。混合对照品色谱图和样品色谱图见图3。9号峰的峰面积和保留时间适中，且分离度较好，可作为参照峰。各共有峰相对于参照峰的相对峰面积，见表2。

表2 16批药材样品HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积

图3 混合对照品色谱图（A）、样品色谱图（B）

2.5 聚类分析

以14号峰为参照，以16批药材样品（编号：S1～S16）中19个共有峰的相对峰面积为变量，组成16×19阶原始数据矩阵，采用SPSS 20.0软件进行聚类分析，采用组间连接法，以欧式距离作为样品的测度。结果，16批药材样品可聚为2类，S6～S9、S13、S14聚为一类，S1～S5、S10～S12、S15、S16聚为一类，见图4。

图4 聚类分析树状图

2.6 主成分（PCA）分析

以9号峰为参照，以16批药材样品（编号：S1～S16）中19个共有峰的相对峰面积为变量，导入SIMCA 14.1软件，进行PCA分析，模型自动拟合选择2个主成分，其累积方差贡献率为85.47 %，提示模型预测良好，见图5。由图5可知，16批药材样品可分为2 组，S6～S9、S13、S14为一组，S1～S5、S10～S12、S15、S16为一组，该结果与聚类分析结果一致。两组车前草药材存在产地交叉情况，因此，产地不能作为车前草质量优劣的唯一标准，需要综合药材各化学成分含量进行整体质量评价[13]。为了更好地考察不同产地车前草药材成分差异的主要标志性成分，进一步采用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）法对样品进行分析。

图5 16批药材样品的PCA得分图

2.7 PLS-DA

PLS-DA主要原理是先利用PLS提取样本的主成分，然后将主成分作为新变量建立训练样本自变量和分类变量之间的回归模型，进行判别分析[14]。本研究对上述两组样品进行PLS-DA分析，绘制PLS-DA模型得分图，见图6。模型的主成分回归系数Q2Y=0.645＞0.5，说明模型的预测能力较强，反映两组样本具明确分离的趋势；R2Y=0.973，说明模型对因变量变异贡献的百分比为 97.3 %，即自变量（共有峰）的变化能解释导致97.3 %不同分类（因变量）发生，模型的拟合度较好[14]。通过VIP（variable importance）图筛选出差异较大成分，见图7。文献指出[15]，VIP＞1的变量对分类起着关键作用。由图 7可知4（大车前苷）、7（毛蕊花糖苷）、17（芹菜素）、14（木犀草素）、6号峰5个成分VIP值均大于1，对车前草药材的质量影响较大。

图6 16批药材样品的PLS-DA模型得分图

图7 16 批药材样品PLS-DA模型中共有峰的VIP值

3 讨论

3.1 色谱条件及提取方法的选择

本研究前期预试验中比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水溶液（0.2 %，0.1 %）、乙腈-甲酸水溶液（0.2 %，0.1 %）、乙腈-乙酸水溶液（0.2 %，0.1 %）等不同流动相系统的分离效果。结果发现，以乙腈-0.1 %乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱时，各峰分离度较好，且色谱峰保留时间适中。通过3D全波长扫描，发现检测波长为330 nm时HPLC指纹图谱色谱峰较多，基线平稳，特征峰信号较明显，故选择330 nm为检测波长。比较超声提取与加热回流提取两种提取方式，结果两种提取方法的效果相当，考虑超声提取操作简单，因此选择超声提取，在此基础上进一步考察提取时间和提取溶剂对HPLC指纹图谱的影响，最终选择用70 %甲醇超声提取30 min。

3.2 化学模式识别结果分析

指纹图谱相似度评价结果显示，16批车前草药材样品的相度为0.854～0.957，表明不同产地车前草药材质量相对稳定；聚类分析和PCA分析结果均显示，16批车前草药材样品分为2类，S6～S9、S13、S14为一组，S1～S5、S10～S12、S15、S16为一组，分析结果表明不同产地的车前草药材质量具有差异性，两组车前草药材存在产地交叉情况，故产地不能作为评价车前草药材质量的唯一标准，药材质量还受采收时间、土壤、降水量、温度等其他因素影响，需要综合整体化学成分的含量特征进行质量评价。通过PLS-DA分析找出影响车前草分类的5个差异性成分，并指认出其中4个影响较大的化学成分，即大车前苷、毛蕊花糖苷、芹菜素、木犀草素，提示车前草药材中这4个成分受生长环境的影响较大，大车前苷和毛蕊花糖苷为车前草主要活性物质[11]，芹菜素、木犀草素为其黄酮类成分[7]，具有良好的抗菌、抗炎、抗氧化等生理活性[6,16]，为车前草主要有效成分[7]，因此在判断车前草药材真伪和优劣时应对上述4个成分重点考察。

本研究采用HPLC指纹图谱结合化学模式识别对不同产地车前草药材进行质量评价，所建立的测定方法准确，稳定性好，灵敏度高，专属性强，可为车前草药材的质量控制和质量鉴别提供有效手段。