哮喘-慢阻肺重叠患者血清中性粒细胞相关因子表达水平

路靓，李鑫，李清岚，陆思静

(1.锦州医科大学；2.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

支气管哮喘(asthma)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是两种常见的呼吸系统疾病。这两种疾病发病机制、临床特征、治疗手段均不相同，然而临床上一些患者同时出现哮喘及慢阻肺症状，这些病人被归为支气管哮喘-慢性阻塞性肺疾病重叠[1](asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap，ACO)。在一些特殊的患者身上，随着其病程的延长、疾病的发展以及年龄的增高，哮喘和COPD会发生相互转变、相互影响和相互作用，导致部分发展为ACO[2]。ACO同时具备哮喘和COPD的特征，患者常有频繁的急性加重、更差的生活质量，病情进展迅速且预后差，死亡率高。而ACO作为近些年提出的新概念，很多发病机制尚不清楚。GINA指出，与哮喘和 COPD 相关的炎性标志物包括呼出气一氧化氮、血嗜酸粒细胞、痰中炎性细胞、IL-6、IL-13、髓过氧化物酶、中性粒细胞等[3]。中性粒细胞及其相关细胞因子被发现与慢阻肺的气道炎性浸润相关[4]，但其在ACO炎症过程中的作用尚待明确。研究ACO相关炎性标志物对ACO的诊断以及提高临床治疗效果具有重要意义。当气道炎症发生时，中性粒细胞会通过产生白介素-8(interleulin-8，IL-8)增强自身的趋化聚集[5]，有研究表明IL-8能对COPD病情严重程度进行有效区分[6]；白介素-17a(interleulin-17a，IL-17a)作为前炎性细胞因子，可募集并活化中性粒细胞[7]，介导局部炎症反应和组织损伤，导致肺组织结构功能破坏；气道上皮Toll样受体家族可以诱导产生多种炎症因子参与气道炎症，而主要由中性粒细胞产生的乳铁蛋白(lactoferrin，LF)则可以通过影响TLR4信号通路调节炎症反应[8]。IL-8、IL-17a及LF作为中性粒细胞相关炎症因子均可参与气道炎症反应，然而现存对IL-8和IL-17a在ACO相关炎症机制的研究较少，且尚未发现对LF在ACO中所起作用的相关研究。因此，探究IL-8、IL-17a及LF这3种中性粒细胞相关炎症因子在ACO患者血清中的表达水平很有必要。

本研究通过比较中性粒细胞相关因子IL-8、IL-17a、LF在ACO、COPD、哮喘急性期及ACO治疗后患者血清表达水平，进一步探讨中性粒细胞相关细胞因子IL-8、IL-17a、LF在ACO诊治中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年11月至2019年4月锦州医科大学附属第一医院呼吸科就诊的ACO、COPD及哮喘急性期患者，按照纳入及排除标准共入选ACO患者32例，COPD患者30例，哮喘患者25例。同时于我院体检中心收集同时期健康人 20例为对照组，收集病例资料，抽取外周静脉血10 mL用于细胞因子的检测。ACO患者规范化治疗1个月后再次抽取静脉血。其中纳入标准如下：(1)ACO患者入组标准：所有患者均为在我院行肺功能检查及支气管舒张试验，参照2017年西班牙慢阻肺指南及哮喘管理指南关于ACO的共识[9]并结合实际情况制定诊断标准如下：支气管舒张试验强阳性，即FEV1改善值>400 mL且改善率>15%； 40岁前有哮喘病史；过敏史；有2次及以上支气管舒张试验结果为阳性，即 FEV1 改善值大于200 mL，且改善率大于12%。在满足COPD诊断标准前提下，符合其中一条诊断标准即可入组；(2)ACO急性期患者入组后需于我院呼吸科病房或门诊行规范治疗，1个月后随访；(3)COPD及哮喘患者分别按照2017年GOLD和GINA制定的诊断标准入组；对照组为体检结果正常的健康人；(4)针对所有入组患者，均已向其告知参与研究事实并签署知情同意书。排除标准：(1)合并有支气管扩张症、肺纤维化、肺动脉高压、肺结核等肺部疾病者；(2)合并恶性肿瘤，严重的心、肝、肾疾病者，或存在精神、神经性疾病所致的认知、交流障碍及自身免疫性疾病者；(3)2 w内有应用激素(包括全身应用及局部吸入糖皮质激素)、抗白三烯受体拮抗剂及茶碱类等相关药物的用药史。

1.2 方法

患者晨起空腹抽取肘正中静脉血10 mL置于EDTA抗凝管中，立即送锦州医科大学附属第一医院变态反应与临床免疫研究中心，将血样在2000 rpm下离心 20 min，取上清液置于冻存管中，-80 ℃冰箱保存。待样本集齐后，室温解冻样本血清，采用ELISA法检测样本血清中IL-17a、IL-8、LF的含量。ELISA试剂盒购于上海纪宁公司，操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 入组患者一般资料比较

本研究共纳入107例患者，分别比较得出4组之间性别、年龄、身高、体重差异均无统计学意义(P均>0.05)，说明4组实验数据间具有可比性，见表1。

2.2 ACO、COPD、哮喘急性期及健康对照组3种细胞因子浓度的比较

通过分析比较得出4组之间血清IL-8、IL-17a和LF水平均有显著的统计学差异(P<0.01)；其中经两两比较，ACO组血清IL-8浓度高于哮喘组和对照组，但明显低于COPD组，哮喘组IL-8水平明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.01)；ACO组血清IL-17a水平较哮喘组高，有统计学差异(P<0.05)，哮喘组IL-17a浓度平均水平虽略高于COPD组，但无统计学差异(P>0.05)，不过两者均高于健康人水平(P<0.01)；ACO组血清LF含量低于哮喘组，差异有统计学意义(P<0.05)，而哮喘组和COPD组LF浓度差异无显著统计学意义(P>0.05)，但均明显低于对照组(P<0.01),见表2、表3。

2.3 ACO治疗前后3种细胞因子浓度的比较

通过配对t检验分析得出，ACO急性加重期患者血清IL-8、IL-17a的表达水平显著高于临床稳定期，血清LF则低于稳定期表达水平，差异均有统计学意义(P<0.01),见表4。

表1 入组患者的一般情况比较

表2 ACO、COPD、哮喘急性期及健康对照组3种细胞因子浓度的比较

表3 ACO、COPD、哮喘组及对照组3种细胞因子浓度的两两比较

表4 ACO治疗前后3种细胞因子浓度的比较

3 讨 论

慢性气道炎症是哮喘和慢阻肺共同特征，哮喘主要为嗜酸性粒细胞活化参与介导，慢阻肺以中性粒细胞浸润为主，同时由多种炎症因子参与。有学者曾提出“荷兰学说”[10]，该学说认为，由于遗传及周围环境影响因素不同，慢性非特异性肺疾病可发展为哮喘、COPD或两者兼有。有研究发现部分哮喘患者与COPD患者相比细胞分类基本相同，部分重症、难治性或激素抵抗型哮喘患者肺组织中性粒细胞浸润明显增加，可能提示病情发展更加迅速，激活的中性粒细胞可以引起氧自由基和多种水解酶的释放，中性粒细胞表达CD11b/CD18增加，若控制不佳，长期的炎症细胞及因子的侵袭可导致气道不可逆气流受限，从而向COPD转变。这是ACO可能的发病原因。故而从中性粒细胞浸润的气道炎症机制入手，寻找ACO特征的炎性标志物对ACO的识别、诊断、治疗具有重要作用意义。

IL-8具有强大的趋化作用，激活并使中性粒细胞及肺泡巨噬细胞聚集于气道黏膜，释放自由基及炎症因子，引起肺血管内皮及肺泡上皮损伤，使血管通透性增加，炎症反应加重，引起气道高反应，使支气管平滑肌痉挛、小气道阻力增加。在IL-8与IL-6等细胞因子共同作用下，还能够增强中性粒细胞的释放蛋白酶的能力，促进成纤维细胞增殖，抑制细胞外基质的分解，使其沉积，从而导致气道重构。本研究发现，血清IL-8表达水平在ACO、COPD、哮喘急性加重期组及健康对照组间存在显著差异，其中ACO急性加重期患者外周血IL-8表达水平高于哮喘急性发作期患者，但低于COPD急性加重期患者。IL-8是在干扰素-α、白介素-1等作用下由单核巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞及Th细胞等合成的炎症因子，作用于中性粒细胞产生趋化作用[11]，通过与中性粒细胞表面特异性受体结合，激活免疫炎症反应，使中性粒细胞脱颗粒，释放溶酶体，释放氧自由基和蛋白水解酶等，还可以自分泌方式募集中性粒细胞，增强中性粒细胞活性，并延长其寿命，如此循环反复，致使气道炎症持续进行。因此IL-8的升高导致气道中性粒细胞炎症和气道持续损伤，而COPD以中性粒细胞浸润为主，血清IL-8在COPD患者中明确升高。有研究报道，非Th2相关细胞因子如IL-8在ACO患者血清浓度高于嗜酸性粒细胞参与介导为主的哮喘患者[12]。这与实验结果相符。ACO兼有COPD和哮喘疾病的特征，中性粒细胞炎症可能比COPD弱而强于哮喘。

IL-17a主要由Th17细胞产生，作为一种前炎性细胞因，它募集中性粒细胞的能力极强，能够诱导气道上皮细胞以及平滑肌细胞产生多种炎性因子。 IL-17a与Th2类细胞因子在黏液大量分泌、平滑肌细胞增生、气道增厚和气道炎症中有协同作用，并可通过促进气道上皮细胞产生趋化生长因子等引起中性粒细胞浸润型炎症。本研究显示，ACO急性期患者血清IL-17a含量明显高于COPD和哮喘组，COPD组和哮喘组差异无统计学差异。分析原因，有研究表明将卵清蛋白致敏小鼠Th17分泌的 IL-17a转移到野生型小鼠中，随后用卵清蛋白激发，可以导致小鼠肺中的中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润增加[13]。中性粒细胞还可以激活基质金属酶、白三烯等促进嗜酸性粒细胞的增殖。结合上述实验结果，IL-17a可能通过引起中性粒细胞及嗜酸性粒细胞炎症反应，参与ACO相关免疫炎症反应。

LF是一种多功能蛋白，具有调节免疫、抗菌抗病毒作用，中性粒细胞是目前发现含LF最多的细胞。血液中的LF主要来源于中性粒细胞，骨髓和子宫内膜也可分泌少量乳铁蛋白。LF可以抑制炎症区域中IL-8的转录和表达，调节炎症细胞的聚集，还可抑制肥大细胞和嗜酸性粒细胞的趋化。本次研究结果显示3个患病组患者血清LF表达水平均较健康对照组明显下降，其中ACO急性期患者LF含量明显低于COPD和哮喘组，COPD组与哮喘组间无明显统计学差异。有研究显示乳铁蛋白可促进T淋巴细胞的成熟，通过诱导CD4+的表达，进而使未成熟T淋巴细胞分化为CD4+T淋巴细胞亚群，调节T淋巴细胞功能，改变Th1和Th2间的平衡，从而使炎症因子释放减少，缓解炎症反应的进行[14]。本研究验证了LF作为抑炎因子的作用，ACO、COPD及哮喘患者外周血LF含量明显减少的原因可能由于LF在抑制气道炎症的过程中消耗过多，也可能由于该类患者体内LF分泌缺陷。

ACO患者治疗前后比较结果可见3种中性粒细胞相关细胞因子均在ACO急性加重的炎症途径中发挥着不可或缺的作用。这也提示可以将血清IL-8、IL-17a及LF浓度检测作为ACO患者治疗效果的观察指标，可以动态监测上述指标用于指导和调整临床治疗方案。另外，在研究ACO炎症机制的基础上，已有正在尝试应用特异性中性粒细胞靶向治ACO；也有通过补充乳铁蛋白加强抗炎作用以缓解慢性气道炎症的尝试，但疗效尚需验证。

综上所述，本研究证实中性粒细胞相关因子IL-8、IL-17a、LF在ACO、COPD及哮喘中发挥的重要作用，作为生物标记物可对3种疾病有一定的鉴别意义。IL-8、IL-17a、LF表达水平在ACO急性发作期与稳定期有明显差异，可作为ACO治疗效果的观察指标，为其诊断和治疗提供依据。但是本实验研究对象样本较少，且可能存在未发现实验处理误差等因素影响，因此针对ACO炎症机制的研究仍需要在临床上进行大数据样本的实验研究。