抗心磷脂抗体阳性复发性流产小鼠胎盘的差异蛋白组学研究

谢雅贞，陆启滨

(1.南京中医药大学太仓附属医院，太仓 215400；2.江苏省中医院，南京 210029)

复发性自然流产(Recurrent Spontaneous Abortion，RSA)是指与同一性伴侣连续2次或2次以上在妊娠20周内的胎儿丢失，是流产类的疑难病，其发病率有逐年上升趋势，严重危害妇女的生殖及心理健康[1]。研究表明，大约1%～3%正常生育的健康妇女和超过15%的RSA患者抗心磷脂抗体(Anticardiolipin antibody，ACA)阳性[2-4]。抗磷脂抗体是一组针对各种带负电荷磷脂的自身抗体的总称，其中以心磷脂抗体(ACA)最具代表性，它的靶抗原是存在于细胞膜和线粒体膜中带负电荷的心磷脂，为甘油磷脂类结构。病理状态下这类磷脂分布到细胞膜外，当其与血清中的β2-糖蛋白1型结合后即暴露出抗原位点，诱导产生相应的自身抗体，即抗β2-糖蛋白1抗体[2-4]。ACA阳性患者体外受精率、妊娠率、着床率均明显下降，流产风险极高[2-4]。因此，ACA 所致的RSA在国内外引起了广泛关注，但目前对于其发生机制的认识仍然不足。近年来，基于宏观角度的蛋白组学和基因组学等组学分析成为研究疾病发生机制的重要方法，通过分析组间差异蛋白，可为探索疾病发生机制提供线索[5-7]。本研究应用非标记定量蛋白质组技术分析ACA阳性复发性流产小鼠胎盘组织中蛋白表达谱特征并进行生物信息学分析，为下一步探讨ACA阳性复发性流产的发病机制和筛选治疗靶点提供参考依据。

材料和方法

一、研究材料

1.实验动物：雄性和雌性BALB/c小鼠(SPF级)各20只，雌性8周龄，体重25±2 g，雄性8～10周龄，体重30±2 g。小鼠由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供(动物许可证号：SCXK(苏)2017-0001，合格证号：No.201902211)。SPF级标准全营养饲料由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

2.主要试剂和仪器：人β2GPI，购自ProSpec公司；BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo Fisher公司；小鼠ACA ELISA试剂盒，购自上海联硕生物科技有限公司；RIPA裂解液购自碧云天生物科技有限公司；抗体HIF-1α(14179)、TLR4(14358)、TSP-1(37879)、Tim-3(83882)、RORγt(16540)和β-actin(5174)均为兔单克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(sc-2004，Santa Cruz，美国)。Eppendorf AG 22331 Hamburg冷冻离心机(Eppendorf，美国)，SpectraMax M2多功能酶标仪(Molecular Devices Corporation，美国)，ChemDoc XRS凝胶成像系统(Bio-rad，美国)，UV-2450型紫外分光光度计(岛津，日本)，ESI-MS/MS LTQ-Velos高分辨质谱仪(Thermo Fisher，美国)。

二、研究方法

1.小鼠模型建立：将雌性实验小鼠适应性喂养2 d后随机分为2组：正常对照组和模型组，每组10只。人β2-糖蛋白I(β2-GPI)用无菌PBS调整浓度为400 μg/ml。模型组第1天腹腔注射人β2-GPI溶液与完全弗氏佐剂(CFA)混合液50 μl(1∶1比例)，第8天注射人β2-GPI与不完全弗氏佐剂(IFA)混合液50 μl(1∶1比例)，正常对照组在相应时间点注射生理盐水50 μl；至第18天两组雌性小鼠与雄性小鼠1∶1合笼，自合笼之日起，每天8：00和14：00点分别观察一次，以见到阴栓为妊娠第0天。

2.动物处理及组织、血清收集：在妊娠第15天时，10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，颈动脉采血，2 000g离心15 min取上清，-80℃保存备用。采血后颈椎脱臼法处死孕鼠，取胎盘、胎鼠进行称重，取出子宫，记录吸收胎个数和存活胎个数。胚胎吸收率按以下公式计算：胚胎吸收率=吸收胎个数/(吸收胎个数+存活胎个数)×100%。血清、胎盘中ACA含量按照ELISA试剂盒操作说明进行。

3.蛋白样品收集处理：按组织样品：裂解液=10 mg∶80 μl的比例，加入RIPA强裂解液，用剪刀剪碎组织，使用组织破碎仪破碎组织(中强度，每次转3 s，停3 s，重复3次)，于冰上放置15 min后，12 000g4℃离心15 min，取上清于-80℃保存备用。

4.蛋白凝胶电泳分离：样品浓度测定参考BCA法。每个样品取25 μg，采用12% SDS-PAGE 进行分离；分离后的凝胶采用考马斯亮兰染色法进行染色，染色后的凝胶Image Scanner 扫描仪进行扫描。

5.差异蛋白质组学分析：每组取3只小鼠的胎盘组织进行Label-free蛋白组学分析，蛋白还原烷基化、酶解及LC-MS/MS上机检测和蛋白搜库由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。

6.生物信息学分析：生信分析数据处理主要用Python软件。利用R语言ggplot2软件包和pheatmap软件包分别绘制差异蛋白的火山图和聚类热图，利用Gene Ontology数据库进行GO富集分析，分析差异蛋白的细胞成分、分子功能及生物学过程；利用KEGG pathway对差异蛋白富集的信号通路进行功能注释分析，通过StringDB蛋白质互作数据库进行蛋白相互作用网络分析。

7.差异蛋白的Western Blot验证：蛋白上样量为40 μg，12%SDS-PAGE，100 V恒压 1 h，湿转法电转移到PVDF膜(95 mA，75 min)，用含5%脱脂奶粉的TBS室温封闭1 h，加入HIF-1αTLR4TSP-1 Tim-3RORγtβ-actin一抗抗体(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜，含0.5%Tween 20的TBS洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的羊抗兔IgG(1∶3 000稀释)，37℃孵育2 h，洗膜同上，加ECL发光显色液，室温反应2 min后于暗室曝光。采用Image J软件处理western blot条带，分析各组条带灰度，计算与内参蛋白β-actin比值。

三、统计学处理

结 果

一、ACA阳性流产模型小鼠与正常对照小鼠的胚胎大体结果

本文成功构建ACA阳性流产小鼠模型。与正常对照组相比，模型组胎鼠重量、胎盘重量显著下降(P<0.05)；胚胎丢失率、血清和胎盘中ACA含量均显著升高(P<0.05)(表1)。

表1 两组小鼠胚胎大体差异比较

二、两组小鼠胎盘组织蛋白的SDS-PAGE的分离结果

正常对照组和ACA模型组各取3只小鼠提取胎盘组织蛋白进行 SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝染色后显示，两组样品的蛋白质迁移带清晰，平行度较好，符合后续实验要求(图1)。

M：Marker；1-3：正常对照组；4-6：ACA模型组

三、两组小鼠胎盘组织差异蛋白的鉴定和筛选

通过非标记定量技术质谱分析，获得的二级质谱图总数为585 740，鉴定到的肽段数目为40 331，蛋白数为4 338，部分肽段质谱图如图2。以差异倍数大于或等于1.5 倍(上调或下调)且P值(T-test检验)<0.05作为标准，与正常对照组相比，ACA模型组小鼠胎盘组织中显著上调的蛋白数为35，显著下调的蛋白数为52。差异蛋白火山图如图3A所示，差异蛋白热图如图3B所示。

图2 部分肽段质谱图

图3 差异蛋白火山图(A)和聚类热图(B)

四、GO富集分析

GO富集分析结果显示，差异蛋白质在生物学过程方面主要与定位和跨膜转运有关；细胞组分方面主要位于细胞外区；分子功能方面主要参与跨膜转运活性调控(图4)。

图4 GO富集柱状图

五、KEGG通路富集分析

据富集结果，绘制富集到的KEGG通路的气泡图(只展示前20的结果)(图5)，KEGG通路富集分析结果显示：差异蛋白质主要在代谢通路和磷脂酶D信号通路富集。

图5 KEGG富集气泡图

六、差异蛋白相互作用分析

利用String DB蛋白质互作数据库(http：//string-db.org/)进行鉴定蛋白的相互作用分析，39个差异蛋白之间存在相互作用(图6)。

红点代表上调蛋白，蓝点代表下调蛋白

七、差异蛋白的Western blot验证

选取已报道与RSA发生发展有关的低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、Toll样受体4(Toll-like receptor4，TLR-4)、凝血酶敏感蛋白-1(Thrombospondin-1，TSP-1)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T cell immunoglobulin mucin-3，Tim-3)以及维甲酸相关孤核受体γt(Retineic-acid-receptor-related orphan nuclear receptor gamma，RORγt)进行Western blot验证。结果显示，ACA模型组小鼠胎盘组织中HIF-1α、TLR-4、TSP-1、Tim-3和RORγt 蛋白表达量显著上升(P<0.05)(图6)，与质谱分析结果一致。

注：与对照组比较，*P<0.05

讨 论

合理可靠的动物模型是疾病发病机制研究的重要基础。研究表明采用β2-GPI主动免疫法可建造稳定可靠的ACA阳性流产小鼠模型，β2-GPI注射入体内，打破了体内的免疫耐受，促使机体产生β2-GPI抗体，形成抗原抗体复合物促使血液凝固，形成血栓，促使血管内皮受到破坏，暴露磷脂结合位点，诱导产生ACA[8-9]。β2-GPI主动免疫法优点主要包括：(1)与其它造模方法相比，此法更接近ACA形成的生理过程；(2)成功率高、模型稳定；(3)操作简单、耗时短、可避免其它因素的干扰[8-9]。本实验给予雌性小鼠β2-GPI后，孕鼠的胎鼠重量及胎盘重量均显著降低，胚胎丢失率显著升高，血清和胎盘ACA浓度显著升高。提示造模成功，为下一步的实验奠定了基础。

非标记定量蛋白质组学技术是蛋白质组学研究的重要内容。通过比较研究对象在生理、病理或外界条件刺激下蛋白质的表达情况，来了解生物的调控机制[10]。近年来，非标记定量蛋白质组学技术已成为疾病发病机制相关研究中蛋白质表达、定性和定量分析的强有力工具[7，11]。本研究利用非标记定量蛋白质组学技术，在ACA阳性小鼠胎盘组织中共鉴定出87个差异蛋白，其中35个显著上调，52个显著下调。GO富集分析结果显示，差异蛋白主要定位于细胞外，参与跨膜转运活性调控。KEGG富集结果表明，差异蛋白主要与代谢和磷脂酶D信号通路有关。蛋白质相互作用网络分析显示，差异蛋白中有39个存在相互作用。这些生物信息学分析结果表明，差异蛋白可能通过这些途径与病理生理过程参与ACA阳性流产的发生。

文献分析发现差异蛋白中与RSA发生发展有关的主要包括：HIF-1α、TLR4、TSP-1、Tim-3和RORγt。我们利用Western blot检测HIF-1α、TLR4、TSP-1、Tim-3和RORγt在两组小鼠胎盘组织的表达，结果发现，与正常对照组相比，它们在ACA模型组中表达均升高，与蛋白组学结果相一致，提示本蛋白组学结果可信。HIF-1α在胎盘绒毛中的表达上调被证明与RSA有关[12]。研究表明TLR4在ACA阳性RSA发生、发展过程中发挥重要作用，可能是通过调控COX-2等细胞因子水平从而导致胚胎异常而引起病理妊娠，最终导致流产的发生[13]。李侠等[14]研究发现，TSP-1的异常表达可使胎盘的血液供应无法正常进行，影响胚胎发育，导致流产。大量研究发现Tim-3在RSA 的外周血和蜕膜组织中的高表达与RSA 的发生发展有关，RSA 患者血清中可溶性Tim-3(sTim-3)和Gal-9 表达增加，表明可溶性共刺激分子sTim-3 可能参与RSA 患者Th1和Th2 细胞的分化调控，使Th1/Th2 平衡偏向Th1，其机制可能为sTim-3与Gal-9 结合后削弱Tim-3/Gal-9 信号通路，传递抑制信号，从而参与RSA 的发生发展[15-18]。RORγt在母-胎界面表达上调影响Treg/Th17分化、生成，使免疫平衡向Th17细胞方向移动，从而破坏免疫耐受，导致RSA发生[19]。虽然如此，但有关HIF-1α、TLR4、TSP-1、Tim-3和RORγt与ACA阳性RSA的关系及具体机制尚需进一步的研究明确。

总之，本研究用非标记定量蛋白质组技术揭示了ACA阳性流产小鼠胎盘组织中蛋白组学变化特征，初步分析了差异蛋白涉及的生物学功能和信号通路，为进一步探讨ACA阳性流产的发病机制和筛选治疗靶点提供线索。