不明原因复发性流产女性FMR1基因CGG重复序列多态性研究

曹琴英，彭园园，穆卫红，孙东兰，张静

(石家庄市第四医院产前诊断中心，石家庄 050000)

临床上自然流产的发生率为15%～25%，其中≥2次流产的患者约占生育期妇女的5%，而≥3次者约占1%。复发性流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)有多种原因，主要包括遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素、免疫功能异常、血栓前状态、孕妇的全身性疾病及环境因素等[1]。然而，50%的RSA患者病因不明。其中，遗传因素被认为是主要的潜在原因[2]。

脆性X智力障碍l号基因(Fragile X Mental Retardation 1，FMR1)，又称家族性智力低下基因，位于染色体Xq27.3。FMR1基因5’端非编码区CGG三核苷酸串联重复序列具有高度多态性。根据美国医学遗传学学院(ACMG)的脆性X检测标准和指南[3]，5～44个CGG重复为正常，45～54个CGG重复为中间型，55～200个CGG重复为前突变，大于200个CGG重复为全突变。全突变的临床表型即为脆性X综合征，在临床上有典型的遗传性智力低下或自闭症等表现。

近年来，多项研究显示，CGG重复序列多态性可能在女性不明原因RSA中发挥重要作用。目前，我国尚缺乏大样本育龄女性FMR1基因多态性的数据，探讨RSA患者FMR1基因CGG重复序列数是否高于普通人群的研究更少。本研究旨在对不明原因RSA女性FMR1基因CGG重复序列多态性的分布特点进行分析，以期为自然流产的病因学研究提供参考。

资料和方法

一、研究对象

研究人群为2018年1月1日至2019年12月31日从石家庄市第四医院复发性流产门诊招募的不明原因RSA患者。RSA定义为3次或3次以上在妊娠28周之前的胎儿丢失。但大多数专家认为，连续发生2次流产即应重视并予评估，因其再次出现流产的风险与3次者相近[1]。

纳入标准：汉族；年龄<40岁，以最大限度减少因卵巢老化导致的流产患者；连续≥2次孕20周以内的妊娠丢失，且临床及实验室检查未检出明确原因。排除标准：感染引起的流产史、当前处于妊娠期或产褥期、血栓性疾病、深静脉血栓形成或肺部病史、子宫或输卵管解剖异常、宫颈机能不全、骨盆手术史(不包括剖宫产)、酗酒/药物滥用、癌症史、染色体异常核型以及辅助生殖技术助孕者。

以同期于石家庄第四医院妇科门诊就诊的年龄匹配(±2岁)的无流产史妇女为对照组。

本研究经石家庄市第四医院伦理评审委员会批准。所有研究对象均自愿进行该项检查，并签署知情同意书。

二、研究方法

1.样品采集与DNA提取：抽取研究对象外周静脉血2 ml，EDTA抗凝。使用QIAamp全血DNA提取试剂盒(Qiagen，德国)提取DNA，实验步骤严格按照试剂盒说明书进行。NanoDrop 1000(Nanodrop，美国)测定DNA浓度。

2.FMR1基因CGG重复数检测：采用FMR1基因CGG重复数检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法，北京阅微基因技术)检测FMRl基因的CGG重复次数。按试剂盒的说明操作，主要步骤如下：(1)建立PCR扩增体系：15 μl全长扩增体系，包括扩增缓冲液11.5 μl、全长扩增引物0.6 μl、酶混合液0.3 μl、无核酸酶纯水1.6 μl，充分混匀后加入待检测1 μl DNA样本；15 μl重复扩增体系，包括扩增缓冲液11.5 μl、重复扩增引物0.6 μl、酶混合液0.3 μl、无核酸酶纯水1.6 μl，充分混匀后加入待检测1 μl DNA样本。(2)PCR反应条件：两种PCR扩增体系的反应条件相同，均为95℃ 5 min，97℃ 35 s、65℃ 35 s(在此步骤中，每1个循环减1℃)、68℃ 4 min共10个循环；然后接97℃ 35 s、62℃ 35 s、68℃ 4 min(在此步骤中，每1个循环增加20 s)，共20个循环；68℃ 10 min后，连接15℃完成扩增反应。(3)毛细管电泳：HiDi Formanmide(ABI，美国)8.7 μl、QD1200(ABI，美国)0.3 μl、PCR产物1 μl配制电泳检测样品，使用POP7胶(ABI，美国)在Applied Biosystems 3500xl DNA测序仪(ABI，美国)上进行毛细管电泳检测。选择“Fragment”电泳方法，具体操作按使用说明书。

3.结果分析：检测数据使用GeneMapper分析软件(ABI，美国)进行数据分析。具体操作步骤参考GeneMapper分析软件用户使用手册。采用目前国内外普遍采用的分类：(1)正常重复范围(n=5～44)；(2)中间型(n=45～54)；(3)前突变(n=55～200)；(4)全突变(n>200)。

三、统计学方法

采用SPSS 24.0统计学软件进行统计分析。在同一个体中FMRl的两个等位基因(CGG)重复次数相对少者定义为allele-1，相对多者定义为allele-2，取allele-2的重复数进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；比较两个队列之间的显著性水平，采用Fisher精确检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、患者一般情况

研究组共纳入不明原因RSA患者340例，平均年龄(32.5±3.2)岁，平均流产次数(2.51±0.53)次。其中，流产2、3、4、5次的患者分别有206例(60.60%)、100例(29.40%)、30例(8.82%)和4例(1.18%)。对照组340例，平均年龄(32.3±3.3)岁。两组病例年龄比较无显著性差异(P>0.05)。

二、两组CGG重复序列数比较

研究组CGG重复序列数范围为15～70次，平均(29.29±5.31)次。共30种不同的CGG重复数，频率最大的重复次数为29次(41.5%)，其次为30次(38.8%)、36次(8.2%)。

对照组CGG重复序列数范围为17～48次，平均(28.88±5.97)次。共29种不同的CGG重复数，频率最大的重复次数为29次(43.2%)，其次为30次(42.6%)、31次(2.9%)。

两组间CGG重复序列数比较无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组FMRl基因CGG重复序列分布比较[n(%)]

三、两组CGG重复序列分型比较

两组均无全突变型携带者。研究组FMRl基因中间型患者8例(2.35%)，对照组FMRl基因中间型1例1/340(0.29%)，组间比较有显著差异(P<0.05)；研究组FMRl基因前突变患者2例(0.59%)，对照组无FMRl基因前突变携带者，组间比较无显著性差异(P>0.05)；研究组中CGG重复≥35次的正常等位基因患者35例(10.29%)，对照组12例(3.53%)，组间比较有显著差异(P<0.05)(表2)。

表2 研究组与对照组CGG重复序列数比较[n(%)]

讨 论

文献报道，FMR1基因前突变与卵巢早衰显著相关，前突变携带者卵巢早衰(POF)发病率高达13%，自然绝经时间较早，与卵巢储备功能相关的指标如血清抗苗勒管激素(AMH)、基础FSH水平等出现异常[4-5]。而且有学者指出，卵巢储备功能减退相关的卵母细胞特异性基因与RSA相关，并提出在不明原因的RSA患者中进行上述相关基因的检测[6]。因此，我们推测FMR1基因在RSA中亦发挥作用。

最近，国内外数篇文献报道了FMR1基因CGG重复序列多态性与反复流产之间的关系。希腊一项前瞻性病例对照研究，对49名≤40岁的不明原因RSA女性及49例年龄匹配的正常女性进行检测发现，CGG重复次数存在显著差异(P=0.027)，流产患者前突变携带风险显著高于正常对照组(OR=4.267)[7]。印度Dean等[8]研究显示，与对照组相比，RSA组中间型等位基因携带者频率更高(5/100 vs.2/100)；此外，RSA组CGG重复数≥35个的正常等位基因的比例更高(24/200 vs.8/200)，单纯CGG重复序列(无AGG嵌入)的比例显著增加(15/200 vs.3/200，P=0.006)。这种单纯CGG重复序列数在下一代中易发生增加，可能具有导致反复流产的致病性后果。国内陈蔚琳等[9]进行的全国多中心横断面研究显示，反复生育失败妇女的FMRl基因前突变携带者发生风险较高，为1/369。针对中国北方育龄期妇女的研究显示，具有自然流产史或因胚胎发育迟缓而人工流产史女性的前突变携带率为1/320，高于无流产史女性的1/756[10]。冯旺琴等[11]研究发现，早期自然流产患者FMRl基因中间型携带率与对照组无显著差异(1/222 vs.1/247)，但前突变携带率显著高于对照组(1/400 vs.1/740，P<0.05)。但本研究发现，不明原因RSA患者FMR1基因的中间型和正常范围内的高CGG重复序列数携带比例均显著高于对照组，而前突变携带率并未显著增加，这与国内冯旺琴等[11]研究结果不同，但与Dean等[8]的研究结果相似。分析可能的原因：一方面可能是本研究的样本量太小，导致了数据偏倚；此外，受试者的遗传背景可能存在一定的地区差异；再者，受试者纳入/排除标准有所差异。本研究的入组标准更为严格，且最大年龄较冯旺琴等[11]研究更小，以最大限度减少因卵巢老化导致的流产患者；而且流产孕周截止时间为孕20周以内，而冯旺琴等[11]研究的受试者均为孕早期(孕5～12周)RSA患者。上述差异可能导致了两项研究结果的不一致。对于我国不明原因RSA患者的FMR1基因CGG重复序列分型特点，尤其与不明原因RSA的相关性还有待更多更大样本量的、设计更严谨的研究予以阐明。

回顾文献，FMR1中间型等位基因与生育力降低、月经不规则、更年期提前、原发性卵巢功能不全(POI)、非整倍体发生率更高以及流产相关[8]。在POI和卵巢储备功能降低患者中，较大的正常等位基因重复频率增加[12]。Kline等[13]的研究显示，与对照组相比，FMR1基因CGG重复序列数增多在三体性自然流产的妇女中所占比例更高。Kline等[13]曾推测流产的增加可能与卵巢卵母细胞池的减少有关，FMRl基因的前突变携带者，卵巢储备功能下降，二者之间可能存在某种关联[14-16]。中间型和较大的正常型FMR1等位基因很可能导致卵巢储备减少，在这种情况下，受损的卵母细胞质量最终可能导致致命的遗传缺陷，如非整倍体，从而导致流产。这一假设得到了如下研究结果的支持：CGG重复次数大于30次的女性卵巢储备减少，AMH和FSH水平等卵巢功能参数异常[17-18]。研究证实，血清AMH水平的降低和血清FSH水平的升高与流产相关，从而提供了中间型和较大的正常型FMR1等位基因与RSA相关的证据[8]。

2013年Banerjee等[19]观察到，在不明原因RSA患者中，PGE2的表达显著增加。脆性X智力障碍相关蛋白1(FXR1)是脆性X智力低下综合征蛋白(FMRP)的同源物，与FXR2结合形成RNA结合蛋白的FXR家族[20]。FXR蛋白靶向RNA结合域[21]具有与转录后调控作用(可能包括mRNA核质穿梭以及翻译)相一致的特征[22]。2019年最新研究发现，FXR1敲除可促进原代细胞滋养层中PGE2的产生。这些结果提示FXR1参与RSA的发病机制。FXR1可能是一种新的COX-2调节因子。与健康对照组相比，RSA患者的滋养层FXR1 mRNA表达水平显著降低，COX-2 mRNA表达水平升高。因此，FXR1在早孕中起着关键作用，可能是RSA的潜在治疗靶点[23]。

本研究的主要局限性在于我们没有分析病例组和对照组的AMH和FSH水平。因此，需要进一步的前瞻性研究来证实FMR1基因CGG重复序列与反复妊娠丢失之间的可能联系，并揭示相关的分子机制。

综上，我们检测了不明原因RSA女性中FMR1基因CGG重复序列数的分布情况。结果表明，较大的正常型以及中间型FMR1等位基因可能在不明原因的RSA中发挥作用。未来还需要对此进行更多的研究，以揭示其分子机制。