常压冷等离子体对食源性腐败菌失活作用机制研究

陈玥，李书红，孟琬星，杨同亮，陈野

（天津科技大学食品科学与工程学院，天津300457）

近年来，生鲜食品具有新鲜、营养丰富等特点受到消费者青睐，消费者对其需求量也不断增加。然而，由于其水分含量高、营养物质丰富，极易被食源性腐败微生物污染[1]。消费者购买、食用被污染的生鲜食品，易患相关食源性疾病，严重的甚至导致死亡。因此，生鲜食品在加工过程中需要进行杀菌处理，以保证食品安全。

杀菌是食品加工业中的重要组成部分，其主要是通过加热、气调包装、紫外、辐照、添加化学防腐剂等物理或化学手段引起腐败微生物失活来完成杀菌过程[2]。然而，在确保食品安全的同时应尽量减少对处理食品感官品质及营养价值的破坏。因此，越来越多的研究报道集中在高压、脉冲电场、超声波以及冷等离子体等非热加工技术[3]。20 世纪90 年代，人们首次将等离子体技术应用于微生物的灭活试验中，随后一直在不断探索，以寻求一种适用于热敏感材料的高效杀菌技术[4-6]。

目前，关于冷等离子体的杀菌研究越来越多，它是通过对气体放电产生反应活性物质、带电粒子以及紫外光等具有杀菌作用的物质[7-8]，导致微生物的失活。冷等离子体对包括细菌、真菌、病毒、细菌孢子以及生物膜在内的多种微生物均具有良好的杀灭作用[9-12]。然而，关于等离子体对不同食源性腐败菌的作用机制的研究报道较少。本研究分别以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为研究对象，将常压冷等离子体技术应用于不同类型食源性腐败微生物中，研究常压冷等离子体（atmospheric cold plasma，ACP）对不同食源性腐败微生物细胞外膜及细胞内含物的作用，探究常压冷等离子体的杀菌机制，为开发常压冷等离子体在不同类型食品杀菌中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌（ATC51813）、金黄色葡萄球菌（CVCC3053）：天津科技大学菌种保藏中心。

肉汤（luria-bertani，LB）培养基（生物试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；胰酪大豆胨琼脂（tryptose soya agar，TSA）培养基、7.5%氯化钠肉汤培养基（生物试剂）：青岛高科园海博生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒、蛋白定量测试盒：南京建成生物工程研究所；细菌DNA 提取试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；戊二醛、氯化钠、无水乙醇（分析纯）：天津市北方天医化学试剂厂；磷酸盐缓冲溶液（生化试剂）：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

CTP-2000K 低温等离子表面处理仪：南京苏曼等离子体科技有限公司；JSM-IT300LV 扫描电子显微镜：日本电子株式会社。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液的制备

挑取适量大肠杆菌接种于50 mL 无菌LB 液体培养基中，于（37±1）℃下160 r/min 培养6 h 得到108CFU/mL大肠杆菌菌悬液；挑取适量金黄色葡萄球菌接种于50 mL 无菌7.5%氯化钠肉汤培养基中，于（37±1）℃下160 r/min 培养10 h 得到108CFU/mL 大肠杆菌菌悬液。

1.3.2 冷等离子体处理

利用介质阻挡放电（dielectricbarrierdischarge，DBD）等离子体处理已制备好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌悬液。分别吸取0.1 mL 大肠杆菌及金黄色葡萄球菌菌悬液于无菌载玻片上，将带有菌悬液的载玻片置于等离子体处理台上，按照表1 所示试验条件进行处理。

表1 等离子体处理条件Table 1 Plasma treatment conditions

1.3.3 菌落计数

等离子体处理对不同类型腐败菌的菌落数根据GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[13]进行测定，并稍作修改。用1 mL 0.85%无菌生理盐水将载玻片上菌悬液洗涤至9 mL 0.85%无菌生理盐水中，依次进行梯度稀释、培养、计数。

1.3.4 扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）

分别吸取5 mL 已制备得到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液于无菌等离子体处理槽内70 W 下处理2 min，回收至无菌离心管内，于4 ℃下冷冻离心，转速为5 000 r/min，离心10 min。弃去上层清液，用0.1 mol/L 的磷酸盐缓冲溶液将沉淀菌体重新悬浮，重复离心步骤。弃去清液，向底部沉淀菌体中加入2.5%戊二醛固定液，于4 ℃下固定2 h。离心弃去固定液，再向沉淀中加入0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（pH 7.2）对菌体进行漂洗，反复这一步骤2 次，每次10 min ～15 min，再使用无菌双蒸水重复漂洗步骤2 次。弃去漂洗液，向沉淀菌体中依次加入30%、50%、70%、80%、90%乙醇溶液对菌体进行梯度脱水，每次10 min～15 min，最后用100%乙醇脱水，此步骤重复2 次，每次10 min ～15 min。弃去上层乙醇溶液，将试管放置于无菌的干燥室内，自然干燥。将得到的菌体样品贴于样品台上，进行喷金处理，通过SEM 观察不同菌体表面形态变化。

1.3.5 菌体蛋白泄露量

吸取已制备的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液置于无菌离心管内，5 000 r/min 离心5 min，用无菌磷酸盐缓冲溶液洗涤两次，将培养基洗去，用无菌磷酸盐缓冲溶液重悬，置于等离子体处理槽内进行杀菌处理，备用。吸取1 mL 菌液置于无菌离心管内，5 000 r/min 离心5 min，吸取上清液通过蛋白质定量试剂盒测定上清液中菌体蛋白的含量。

1.3.6 丙二醛（MDA）生成量

吸取已制备的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液置于无菌离心管内，5 000 r/min 离心5 min，用无菌磷酸盐缓冲溶液洗涤两次，将培养基洗去，用无菌磷酸盐缓冲溶液重悬，置于等离子体处理槽内进行杀菌处理，备用。吸取1 mL 菌液置于无菌离心管内，5 000 r/min离心5 min，吸取上清液通过丙二醛（MDA）测试盒测定MDA 的生成量。

1.4 数据处理

所有试验均重复3 次，数据结果以平均值±标准差表示，采用Origin 9.0 对数据进行绘图，数据平均值差异性分析采用SPSS 22.0（p＜0.05）进行分析。

2 结果与分析

2.1 常压冷等离子体对不同食源性腐败菌菌落数的影响

2.1.1 处理时间对不同食源性腐败菌菌落数的影响

处理时间对不同食源性腐败菌菌落数的影响见图1。

图1 处理时间对不同食源性腐败菌菌落数的影响Fig.1 Effect of ACP treatment time on colony number of food-borne spoilage microorganisms

如图1 所示，随着常压冷等离子体处理时间的增加，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数减少对数值均呈现增加趋势。这表明杀菌效果随等离子体处理时间的延长而增强。马良军等[14]也得到了类似的结论，处理时间的增加能显著增强等离子体的杀菌效果。不仅如此，在处理时间较短时（＜10 s）大肠杆菌菌落数减少的对数值大于金黄色葡萄球菌菌落数减少的对数值，表明在较短时间内产生的等离子体中的活性物质对大肠杆菌作用较强。

2.1.2 电源功率对不同食源性腐败菌菌落数的影响

电源功率对不同食源性腐败菌菌落数的影响见图2。

图2 电源功率对不同食源性腐败菌菌落数的影响Fig.2 Effect of ACP power on colony number of food-borne spoilage microorganisms

如图2 所示，随着常压冷等离子体电源功率的增大，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数减少对数值均呈现增加趋势。这表明，杀菌效果随等离子体电源功率的增大而增强。不仅如此，大肠杆菌菌落数减少的对数值小于金黄色葡萄球菌菌落数减少的对数值，表明电源功率的增加激发得到的等离子体中存在不同活性物质，且对不同类型微生物的作用效果不同。此外，当氧气浓度达到一定时，可激发得到的杀菌活性物质含量达到饱和[14]，产生的氧化活性物质含量受限。

2.1.3 电极间距对不同食源性腐败菌菌落数的影响

电极间距对不同食源性腐败菌菌落数的影响见图3。

如图3 所示，随着常压冷等离子体电极间距的减小，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌落数减少对数值均呈现增加趋势。这表明，杀菌效果随等离子体电极间距的减小而增强。不仅如此，大肠杆菌菌落数减少的对数值大于金黄色葡萄球菌菌落数减少的对数值，表明大肠杆菌对常压冷等离子体电极间距的变化更加敏感。

图3 电极间距对不同食源性腐败菌菌落数的影响Fig.3 Effect of ACP electrode spacing on colony number of food-borne spoilage microorganisms

2.2 等离子体对不同食源性腐败菌形态的影响

常压冷等离子体对不同食源性腐败菌形态的影响见图4。

图4 常压冷等离子体对不同食源性腐败菌形态的影响Fig.4 Effect of ACP on morphology of food-borne spoilage microorganisms

如图4 所示，与未处理的大肠杆菌相比，等离子体处理后的大肠杆菌表面出现干瘪、褶皱等现象，甚至出现了菌体细胞破碎等现象。Laroussi 等[15-16]也得到了类似的结论，研究报道了革兰氏阴性细菌的细胞外膜被等离子体短时间处理后发生破裂等现象，随后菌体内含物外露。而等离子体处理的金黄色葡萄球菌与未处理组相比并未出现前者菌体破损的现象，仅仅是表现为菌体表面变得粗糙，出现不同程度的褶皱、干瘪等现象，以及轻微的粘连现象。出现这一现象的原因可能是由于金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性细菌，大肠杆菌为革兰氏阴性细菌。一般情况下，革兰氏阳性细菌的细胞外膜较革兰氏阴性细菌的细胞外膜更厚，导致其具有更大的张力及硬度[17]。Lunov 等[18]也得到了类似的结论，革兰氏阴细菌比革兰氏阳性细菌更容易受到等离子体对细胞膜的破坏。Vadillo-Rodríguez 等[19]也认可革兰氏阴性菌在生理结构及功能上比革兰氏阳性菌弱的假设。常压冷等离子体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的外膜均具有损伤作用，这可能是等离子体引起的脂肪酸过氧化物的形成[16]以及等离子体中的电荷在细胞外膜表面积累造成的菌体膜脂被破坏[20]。表面电荷的积累会使细胞膜表面张力远远小于产生的静电力，从而诱发了微生物细胞膜被破坏[21]。

2.3 常压冷等离子体对不同食源性腐败菌菌体蛋白质泄露量的影响

常压冷等离子体对不同食源性腐败菌菌体蛋白质泄露量的影响见图5。

图5 常压冷等离子体对不同食源性腐败菌菌体蛋白质泄露量的影响Fig.5 Effect of ACP on protein leakage quantity of food-borne spoilage microorganisms

如图5 所示，与未处理的大肠杆菌相比，等离子体处理后的大肠杆菌菌体蛋白质泄露量出现增加。Yusupov 等[22]也得到了类似的结果，研究报道了等离子体中含有大量的活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS），主要包括·OH、O、O3和H2O2等物质，这些物质会破坏肽聚糖结构上的重要化学键（即肽聚糖与肽聚糖之间的C-O 键、C-N 键或者C-C 键），导致细菌细胞壁被破坏，内含物泄露出来。当微生物的细胞外膜遭到臭氧、过氧化氢、羟基自由基等氧化作用物的破坏，进而失去自身防御机制而失活[23]。强氧化活性物不仅破坏微生物的外部保护结构，改变其细胞外膜的通透性，还会破坏微生物内外系统的平衡，引起微生物中的酶类、蛋白质以及核酸等内含物的变化，导致微生物失活[24-25]。不仅如此，等离子体处理金黄色葡萄球菌蛋白质泄露量也得到了类似的结果，但其泄露量低于大肠杆菌菌体蛋白质的泄露量。这可能是因为金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性细菌，其细胞外膜较革兰氏阴性细菌更厚，经等离子体处理仍然能保持其外膜的相对完整性，并未出现菌体整个破裂的现象，进而导致蛋白质的泄露量低于大肠杆菌。此外，蛋白质、核酸、脂类、碳水化合物等对活性氧等强氧化性物质较为敏感[26]，极易被氧化变性。在等离子体处理时间增加的过程中，出现蛋白质泄露量的减少可能是因为低温等离子体中含有大量活性氧，这些活性物质极易造成蛋白质的氧化损伤。Montie 等[16]也提出，等离子体对微生物的致死机制是由于氨基酸对氧化作用极其敏感，当大量氧化性物质其接触后会引起蛋白质被氧化而发生变性。另外，细胞膜上的不饱和脂肪酸的磷脂双分子层也极易被氧化，导致多肽链断裂，进而引起氨基酸侧链被氧化[27]。

2.4 常压冷等离子体对不同食源性腐败菌丙二醛生成量的影响

常压冷等离子体对不同食源性腐败菌丙二醛生成量的影响见图6。

图6 常压冷等离子体对不同食源性腐败菌MDA 生成量的影响Fig.6 Effect of ACP on MDA generation of food-borne spoilage microorganisms

如图6 所示，随着等离子处理时间的增加，大肠杆菌的丙二醛生成量呈现增加的趋势，这表明随着等离子体处理引起大肠杆菌细胞外膜被氧化生成脂质过氧化物，脂质过氧化反应是由于不饱和脂肪酸受到等离子体中产生的羟基自由基的攻击造成的[16]，在等离子体氧化细胞膜的这一过程中，氧自由基作用于细胞膜上的多不饱和脂肪酸产生丙二醛，导致丙二醛含量增加。不仅如此，丙二醛的产生还可引起大肠杆菌细胞膜的整体结构被破坏以及功能特性丧失，进而引起细胞膜中不饱和脂肪酸含量的减少，细胞膜电势发生变化，最终导致其细胞膜完全丧失流动性。而随着处理时间的增加，金黄色葡萄球菌的丙二醛生成量呈现波动的趋势。这可能是因为在等离子体中存在大量的电子和离子以及自由基，丙二醛的产生是由自由基引起的[28]。金黄色葡萄球菌的细胞膜结构较为特殊，抑制了自由基的氧化作用，放电区域内电子及离子通过物理撞击作用导致细胞膜出现破损，而自由基则主要通过化学刻蚀作用导致细胞膜的破裂，在等离子体处理过程中自由基及带电粒子交替破坏细胞外膜，而且SEM 观察结果中显示金黄黄色葡萄球菌的细胞膜在等离子体处理后并未出现破碎等现象，仅出现褶皱干瘪等现象，说明低温等离子体对金黄色葡萄球菌致死机制可能更多的是与等离子体中带电粒子的物理撞击有关。

3 结论

采用常压冷等离子体处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，得到随着等离子体处理时间延长、电源功率的增大或者电极间距的减小，引起两种不同类型的食源性腐败菌的失活效果增加。不仅如此，常压冷等离子体引起大肠杆菌的失活主要与其含有大量活性物的氧化作用引起菌体细胞外膜的破裂有关。常压冷等离子体引起金黄色葡萄球菌的失活主要与其含有带电粒子的物理撞击作用引起菌体细胞外膜被刻蚀有关。因此，常压等离子体引起不同类型食源性腐败菌的失活效果明显且作用机制不同，为常压冷等离子体在热敏食品杀菌中的应用提供理论基础和参考依据。