枯草芽孢杆菌J530菌株产芽孢发酵条件的优化及鸡粪氨减排效果

张 颖,杜国霞,冯丽丽,王晓玉,刘 双,王 超,姜军坡,王世英

(1.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定071000； 2.石家庄市农业综合行政执法支队，河北 石家庄 050000；3.河南省农业科学院 农业经济与信息研究所,河南 郑州 450002； 4.河北省畜牧总站，河北 石家庄050000)

氨是禽舍产量最多、危害最大的有害气体。舍内氨气浓度超标会对家禽上呼吸道产生腐蚀和刺激作用，引发多种呼吸道疾病，诱发腹水综合征[1]，降低脾脏的免疫作用[2]，也会使家禽的血氨浓度升高引起氨中毒[3]，影响其健康和生产性能[4-5]。同时威胁饲养员的身体健康[6]，造成周围空气、土壤和水体的污染[7]。降低家禽粪便氨排放对提高家禽生长性能、促进环保养殖和养殖业可持续发展具有重要意义。

由于鸡的消化道很短且具有粪尿合一的特点，因此，食物只在消化道中短暂停留，大部分含氮化合物都随粪便排出体外。而尿酸是家禽排泄物中氮存在的主要形式，可占到总氮的70%，尿酸分解是禽舍氨气的主要来源[8]。尿酸经尿酸酶、尿囊素酶、尿囊酸酰胺水解酶及脲基羟基乙酸酶等一系列酶的作用生成尿素和乙醛酸，随后尿素在粪便微生物脲酶的作用下转化为氨(铵)和二氧化碳[9]。在氨气产生过程中，脲酶起到了关键的作用。因此，抑制鸡粪便中脲酶的活性可以阻止尿素向氨的转化，从而降低氨气的排放。将脲酶抑制剂用于家禽养殖业氨减排已有较多研究，张洪芳[10]通过在家禽排泄物中添加NBPT可降低氨气排放达71.86%，孙得发等[11]通过在肉仔鸡日粮中添加脲酶抑制剂显著降低了鸡舍中的氨气浓度，张金凤[12]通过在肉鸡日粮中添加乙酰氧肟酸降低了排泄物中的脲酶活性和氨态氮含量。总之，目前脲酶抑制剂在家禽粪便氨减排研究中的主要应用方式是在家禽日粮中或其粪便中直接添加一些天然的或人工合成的脲酶抑制剂，而利用产脲酶抑制剂的微生物进行氨减排的研究尚未见报道。

J530菌株是河北农业大学制药工程系实验室筛选得到的1株枯草芽孢杆菌，其摇瓶发酵液对大豆脲酶活性抑制率为98.35%。为提高J530菌株摇瓶发酵产芽孢浓度，并探究其在鸡粪氨减排中的应用效果，以芽孢浓度为指标，对该菌株进行摇瓶发酵条件优化，并研究其菌剂对新鲜鸡粪的氨减排效果，为该菌株在养殖业氨减排中的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌种

J530菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，从鸡粪中分离筛选得到的能抑制脲酶活性的菌株。

1.2 样品

新鲜鸡粪取自保定市清苑区某蛋鸡养殖场。

1.3 培养基

NA、NB培养基：按文献[13]配方配制。

基础培养基：葡萄糖1.5%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.5%、Na2HPO40.2%、KH2PO40.2%、pH值7.0。

1.4 菌种活化及种子液的制备

用灭菌竹签从4 ℃保存的J530菌种斜面上挑取少量菌苔，接种于NA斜面，37 ℃恒温培养24 h，备用。

取5 mL无菌水倒入上述菌种斜面，刮取菌苔制成菌悬液，接入装液量为100 mL(250 mL锥形瓶)的NB培养基中，37 ℃条件下150 r/min摇床培养12 h，即为种子液。

1.5 芽孢浓度的测定

发酵液芽孢浓度：先将发酵液在80 ℃水浴处理15 min，10倍梯度稀释后，采用平板活菌计数法测定[13]。选择30～300 cfu/皿的平板进行菌落计数。芽孢浓度(cfu/mL)=菌落数×稀释倍数/涂布菌液的体积。

菌剂芽孢浓度：称取5.0 g菌剂加入到装有45 mL无菌水和15 粒玻璃珠的250 mL锥形瓶中，置于180 r/min摇床上摇动15 min，制成均匀的芽孢悬浊液。后续步骤和计算同上。

1.6 培养基优化试验

1.6.1 碳源的优化 分别以葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、可溶性淀粉、玉米粉替换基础培养基中的碳源，含量为1.5%，其他培养条件为装液量100 mL、接种量6.0%、37 ℃条件下150 r/min摇床培养48 h。测定发酵液芽孢浓度，并以芽孢浓度为指标确定最佳碳源。

1.6.2 氮源的优化 以上述最佳碳源作为碳源，分别以蛋白胨、酵母浸膏、硫酸铵、黄豆饼粉、磷酸二氢铵、胰蛋白胨替换基础培养基的氮源，含量均为1.0%，其他培养条件同上。测定发酵液芽孢浓度，并以芽孢浓度为指标确定最佳氮源。

1.6.3 无机盐的优化 以上述最佳碳源、最佳氮源为碳源、氮源，分别以NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O替换基础培养基的无机盐，含量为0.5%，其他培养条件同上。测定发酵液芽孢浓度，并以芽孢浓度为指标确定最佳无机盐。

1.6.4 培养基组成优化正交试验 利用单因素试验优选出的最佳碳源、氮源和无机盐，设计正交试验因素水平见表1，利用L9(33)正交表进行试验。以摇瓶发酵液芽孢浓度为指标，确定最优培养基组成。

表1 培养基组成正交试验的因素水平

1.6.5 其他发酵条件优化正交试验 利用培养基优化后的配方配制摇瓶发酵培养基，以发酵液芽孢浓度为指标，利用L9(34)正交表对摇瓶发酵时间、装液量、初始pH值、接种量等发酵条件进行优化。因素水平设计见表2。

表2 发酵条件正交试验的因素水平

1.7 菌剂应用试验

1.7.1 菌剂制备 采用优化后的培养条件摇床培养5.0 L发酵液，6 000 r/min离心，取菌体用适量麸皮吸附，50～55 ℃鼓风干燥，粉碎制成芽孢浓度为1.0×1010cfu/g的菌剂。

1.7.2 菌剂活化 将以上菌剂按1∶100(m/V)与2.0%的红糖水混匀，在室温(25～35 ℃)下活化4 h，备用。

1.7.3 试验设计 称取200.0 g新鲜鸡粪放入1 000 mL广口瓶中，接入上述活化菌剂22.0 mL并充分混匀，使接种后鸡粪中J530菌体的浓度为1.0×107cfu/g。然后再在广口瓶里的鸡粪上放一个盛有40.0 mL氨气吸收液[14]的100 mL小烧杯。同时以22.0 mL红糖水代替活化菌剂作为对照。盖好瓶塞，30 ℃静置5 d后测定鸡粪芽孢杆菌浓度、脲酶活性、氨气释放量、pH值及氨氮、尿素、尿酸、总氮等含量。

1.7.4 鸡粪中芽孢杆菌浓度测定 测定方法与1.5中的菌剂芽孢浓度测定相同。

1.7.5 鸡粪pH值检测 称取鸡粪10.0 g于250 mL锥形瓶中，加入去离子水20.0 mL，充分搅拌均匀，6 000 r/min离心15 min，用pH计精确测定上清液。

1.7.6 其他指标检测方法 鸡粪中脲酶活性检测采用文献[15]所示方法；鸡粪中氨态氮及鸡粪氨气释放量检测采用文献[14]的方法；鸡粪中尿素、尿酸含量检测采用文献[16—17]中的试剂盒法(试剂盒由南京建成生物工程研究所生产，编号为C012-1、C013-1)；鸡粪中总氮含量测定采用文献[18]的方法。

2 结果与分析

2.1 碳源对J530菌株摇瓶发酵液芽孢浓度的影响

碳源种类对J530菌株摇瓶发酵液芽孢浓度的影响见图1。玉米粉为碳源时芽孢浓度最高，达到6.55×108cfu/mL，且玉米粉廉价易得，故选择玉米粉为最优碳源。

图1 碳源种类对芽孢浓度的影响

2.2 氮源对J530菌株摇瓶发酵液芽孢浓度的影响

氮源种类对J530菌株摇瓶发酵液芽孢浓度的影响见图2。以黄豆饼粉作为氮源时，芽孢浓度达到最高，为1.70×109cfu/mL。因此，选择黄豆饼粉为最佳氮源。

图2 氮源种类对芽孢浓度的影响

2.3 无机盐对J530菌株摇瓶发酵液芽孢浓度的影响

无机盐种类对J530菌株摇瓶发酵液芽孢浓度的影响见图3。以MgSO4·7H2O作为无机盐时，芽孢浓度最高，达到了3.35×109cfu/mL。因此，选择MgSO4·7H2O为最适无机盐。

图3 无机盐种类对芽孢浓度的影响

2.4 培养基组成优化

培养基组成正交试验结果见表3。由极差分析结果可知，R玉米粉>R黄豆饼粉>RMgSO4。可见，对J530菌株摇瓶发酵产芽孢影响最大的是玉米粉，其次是黄豆饼粉。

表3 培养基组成正交试验结果

比较各因素水平的均值可得：A2>A3>A1，B3>B2>B1，C1>C2>C3，故最佳培养基组成为A2B3C1，即玉米粉1.5%、黄豆饼粉1.5%、MgSO4·7H2O 0.3%，该组合下摇瓶发酵液的芽孢浓度为4.26×109cfu/mL。

2.5 其他发酵条件优化

发酵时间、装瓶量、初始pH值、接种量对摇瓶发酵液芽孢浓度的影响见表4。

从表4均值分析可知，最优组合为A2B1C3D1，但该组合未在上述试验中出现。因此，将最优组合A2B1C3D1和芽孢浓度最大的5号组合A2B2C3D1进行验证，结果最优组合A2B1C3D1条件下的芽孢浓度为7.30×109cfu/mL，而A2B2C3D1培养条件下芽孢浓度为6.88×109cfu/mL。因此，确定最优发酵条件为A2B1C3D1，即发酵时间36 h、装瓶量50 mL、初始pH值8.0、接种量4.0%。

综上所述，枯草芽孢杆菌J530菌株产芽孢的最优培养基组成和发酵条件：玉米粉1.5%、黄豆饼粉1.5%、MgSO4·7H2O 0.3%、Na2HPO40.2%、KH2PO40.2%、发酵时间36 h、装瓶量50 mL、初始pH值8.0、接种量4.0%、培养温度37 ℃、摇床转速150 r/min。J530菌株摇瓶发酵液的芽孢浓度较优化前(3.27×108cfu/mL)提高了20.32倍。

表4 发酵条件正交试验结果

2.6 J530菌剂应用效果

从表5可知，与对照组相比，5 d后试验组的芽孢杆菌含量提高了60.29倍(P<0.01)、脲酶活性降低了80.78%(P<0.01)、5 d氨气释放量减少了67.78%(P<0.01)、pH值降低了1.35(P<0.05)、氨氮含量降低了48.57%(P<0.01)、尿素含量提高了24.79%(P<0.05)、总氮含量提高了8.53%(P>0.05)、尿酸含量提高了0.91%(P>0.05)。5 d后，试验组鸡粪中芽孢杆菌含量增加，说明J530菌株可在鸡粪中生长繁殖，这与鸡粪中脲酶活性降低、pH值降低及其他参数的变化均具有直接或间接的因果关系。

表5 J530菌剂应用效果

3 结论与讨论

3.1 发酵条件优化指标

枯草芽孢杆菌的芽孢具有较强的抗逆性，能耐热、酸、碱等不良环境。芽孢浓度是这类微生物制剂质量的重要指标。因此，发酵液的芽孢浓度也成为该类菌株发酵条件优化时的主要指标[19-20]，标志着产品的发酵生产水平。本研究以发酵液芽孢浓度为指标优化枯草芽孢杆菌J530菌株的摇瓶发酵条件，为其芽孢菌剂的发酵生产提供依据。

3.2 J530菌株的氨减排作用

目前，利用微生物进行家禽养殖业氨减排的研究多集中在筛选产蛋白酶的菌株以增强家禽对饲料蛋白的消化能力[21]、筛选能够抑制产氨菌生长的微生物[22]、筛选具有高效氨氮降解能力的菌株[23]等方面。但在家禽粪便中添加抑制脲酶活性的微生物用于氨减排的研究尚未见报道。J530菌株是河北农业大学制药工程系实验室从鸡粪便中分离得到的氨氮高效利用并能产生脲酶抑制剂的菌株。因此，该菌株在应用试验中可以利用鸡粪便中的氨氮及菌剂活化所提供的糖分等作为营养物质进行生长，同时产生脲酶抑制剂，抑制粪便中的脲酶活性，减少尿素向氨的转化，从而引起粪便氨氮含量显著降低，pH值随之降低，同时也引起尿素的积累。但试验组尿酸含量与对照组相比无显著变化，可能是尿酸转化为尿素的中间步骤未受到影响所致。以上结果提示，该菌剂如能用于鸡粪便的堆肥，可减少鸡粪便的氨排放，降低对环境的污染，同时起到粪便保氮、提高肥效的作用。

3.3 J530菌株的应用前景

在猪、鸡、牛、羊等各种畜禽养殖过程中都会产生氨气，据统计，全球70%～80%的氨气均来自畜牧生产，远远超过了工业氨气排放，而其中50%以上是由畜禽粪便产生的[24]。以养猪为例，猪只能利用饲料中30%～55%的氮，其余大部分以粪尿形式排出，而尿氮中97%的氮是以尿素的形式存在，占总摄入氮的50%左右[4]。J530菌株可以产脲酶抑制剂，用于畜禽粪便堆肥，能抑制粪便中尿素向氨的转化，从而减少氮素损失，提高堆肥产品的含氮量；用于生产微生物饲料添加剂，可降低动物肠道脲酶活性，从而降低肠氨、血氨等，降低氨代谢所需要的能量，提高生长性能[3]，且随粪便排出体外后仍具有氨减排效果。该研究为健康、环保养殖提供了新菌源。

综上，发酵条件优化后，J530菌株摇瓶发酵液的芽孢浓度较优化前提高了20.32倍；应用试验表明，J530菌株可在鸡粪便中生长繁殖，使鸡粪便脲酶活性、氨氮含量及pH值显著降低，尿素含量显著提高，总氮含量有所提高，从而显著降低鸡粪便的氨气排放量。