鲫鱼Vitellogenin基因的克隆与组织表达分析

李 青，何 斌，赵海涛

(1.贵州省普通高等学校生物资源开发与生态修复特色重点实验室,贵州 毕节 551700；2.贵州工程应用技术学院 生态工程学院，贵州 毕节 551700)

卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)于1953年首次在惜古比天蚕蛾(Hyalophoracecropia)血液中被发现[1]，最初是对雌性昆虫血液淋巴蛋白的特称[2],后广泛定义为特异存在于非哺乳类性成熟卵生雌性动物卵黄生成期血液中的一类蛋白质。繁殖期内鱼类血清中Vtg水平呈现规律性波动[3-5]，斑马鱼(Daniorerio)和斑点叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)中Vtg含量与其成熟指数密切相关[6-7]。Vtg的合成主要受雌激素调控，可在成熟雌性动物体中大量表达，雌雄个体间Vtg的表达水平具有显著差异，Vtg被用于动物成熟程度、外部性征不明显动物的性别鉴定。Vtg的合成包括内源性和外源性2种方式，大多数鱼类中Vtg的合成方式为外源性，Vtg在卵巢外组织肝脏中翻译为前体蛋白之后，会经历一系列的修饰、剪切、分泌、运输和受体识别，最后储存于卵巢组织，为胚胎发育提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素及微量元素等营养[8]。其中，Vtg的剪切是通过枯草芽孢杆菌酶及其同工酶完成，大多数Vtg同源蛋白具有一个或多个蛋白质水解酶切位点(RXXR)，对于具有多个RXXR位点的Vtg同源蛋白，只有部分酶切位点可以发生剪切[9]。如褐飞虱Vtg具有3个RXXR位点，但仅在最保守的位点进行剪切[10]，蟑螂具有5个酶切位点，只在其中3个位点发生剪切[11]。

Vtg蛋白具有结构保守性和多样性，且分布广泛，表明其生物学功能的多样性[9]，如在鱼中发现Vtg可以激活IgG Fc段受体(FcγR)，介导芽孢杆菌和大肠杆菌的吞噬作用[12-13]，中和血液中的病毒[14]，促进培养中的动物卵母细胞的生长和分化[15]，结合并转运金属离子至卵母细胞[16]，调节社会型昆虫的觅食行为、劳动分工和味觉反应性变化[17]，协助精子受精[18]及降低氧化压力[19]。1个完整的Vtg蛋白分子包括N端信号肽、卵黄脂磷蛋白重链(Lipovitellin heavy chain，LvH)、卵黄脂磷蛋白轻链(Lipovitellin light chain，LvL)、Vwfd (Von wilebrand factor type D domain)和富含磷酸化多聚丝氨酸(Phosvitin,Pv)结构域。在硬骨鱼中，Vwfd被切割成β′-C和CT两部分。随着生物技术的发展和研究的不断深入，一些非完整类型的Vtg也被发现[20-23]，卵黄蛋白原C蛋白(VtgC)属于这种类型，该蛋白质的氨基酸序列中只含有LvH和LvL，不含有Pv和β′-C结构域。由于Pv结构域含有多聚丝氨酸区域，该区域是通过氨基酸密码子连续扩增而产生，因此，具有该区域的Vtg亚型进化速度比其他亚型快[24]。由于物种进化速度不同，Vtg在不同物种间显示出较大分歧度。因此，Vtg是很好的系统进化分析的分子标记[25]，其序列数据可应用于系统进化研究。

鲫鱼(Carassiusauratus)隶属于硬骨鱼纲辐鳍亚纲，鲤形目鲤科鲫属，广泛分布于欧亚大陆，由于其营养价值丰富和养殖灵活，很早就成为我国广泛水产养殖物种。目前，我国已是世界上最大的鲫鱼生产国。鲫鱼冬季可在低温下忍受数月缺氧，被认为是最耐低氧的鱼类之一[26]。鲫鱼不仅是一种重要水产养殖物种，还被认为是研究鱼类进化和耐低氧适应分子机制的适当模型。目前，关于鱼类多倍体的起源、遗传多样性和耐低氧的机制尚未完全了解，在鲫鱼上开展的Vtg研究多集中于其作为理想雌激素及类雌激素标志物应用于水环境内分泌干扰物检测和评价[27-29]。开展Vtg蛋白结构、表达模式及生物功能的研究，不仅为水产物种人工繁殖、病害防治和资源保护等工作奠定重要理论基础，还可为进一步探究鱼类进化和耐低氧分子机制提供依据。目前，GenBank数据库中的鲫鱼Vtg基因序列只有部分片段(GenBank No.:JQ776511.1和ABG22139)，关于鲫鱼Vtg基因不同亚型结构和表达分析的研究还鲜见报道。为此，以鲫鱼转录组数据为基础，利用分子生物学技术克隆获得鲫鱼中Vtg基因2个亚型(分别命名为Ca-VtgAo1和Ca-VtgC)的cDNA全长序列，利用生物信息学方法对鲫鱼中2个Vtg基因编码的氨基酸序列组成、理化性质和结构域等进行分析，揭示其不同亚型的分子特征。此外，利用实时荧光定量PCR分析Ca-VtgAo1mRNA在雌雄鲫鱼不同组织中的表达情况，为进一步探究Vtg不同亚型的生物学功能及其分子机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

分别取雌性性成熟鲫鱼的肾脏、卵巢、肝脏、鳃、肠和心脏组织，雄性性成熟鲫鱼的肾脏、精巢、血液、鳃、肝脏和脾脏组织，用液氮冷冻并于-80 ℃保存，备用。

1.2 鲫鱼Ca-VtAo1和Ca-VtgC cDNA全长的克隆和生物信息学分析

提取雌性鲫鱼肝脏组织总RNA，将RNA反转录为cDNA(TaKaRa PrimeScript Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit)。从鲫鱼转录组数据库筛选Vtg基因片段，根据Vtg已知片段设计特异性引物(Ca-VtgAo1上游引物：5′-TGACCAAGACTTTCACCATC-3′，下游引物：5′-ATGCGAGACCTGGACCCTGA-3′;Ca-VtgC上游引物：5′-TCATTGGCGAATCACCTCA-3′，下游引物：5′-TGCCTGTCCAGCCTCATT-3′)验证转录组中Vtg片段序列的正确性。以验证后的Ca-VtgAo1和Ca-VtgC正确序列为模板设计引物(Ca-VtgAo1上游引物：5′-ATTGCCCGTGCTGTGAGA-3′，下游引物：5′-GCAGCAAGTTGGTAGCC-3′;Ca-VtgC上游引物：5′-AAAGTTCCTTCCAGGCTACAC-3′，下游引物5′-CTTTTCCCAGGTAAGCCATT-3′)，采用RACE PCR技术克隆Vtg cDNA末端(Bio-Rad SMARTerTMRACE cDNA Kit)，反应条件：94 ℃预变性1 min;94 ℃变性30 s,58 ℃复性30 s，72 ℃延伸3 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。使用DNAStar SeqMan软件拼接获得Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因cDNA全长序列。使用美国国立生物技术信息中心数据库中BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)程序比对Ca-VtgAo1和Ca-VtgC与其他物种Vtg基因的同源性，确保克隆获得目的基因序列的正确性。利用在线软件ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析Ca-VtgAo1和Ca-VtgCcDNA序列中开放阅读框及其编码的氨基酸序列，利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因编码氨基酸序列的功能域，利用SignalP4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services-/SignalP)预测Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因编码的氨基酸序列是否含有信号肽，利用ExPASy (http://web.expasy.org/protparam) 分析Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因编码蛋白质的分子质量及等电点(pI)。

1.3 Vtg同源蛋白序列比对和系统进化树的构建

使用BLASTX分别搜索与Ca-VtgAo1和Ca-VtgC蛋白同源性高的动物蛋白质序列(表1)，使用DNAMAN软件比对不同物种间Vtg同源基因编码的氨基酸序列的相似度，然后使用MEGA 4.0软件进行同源与聚类分析，采用邻接法(Neighbor-joining,NJ) 构建系统进化树。

表1 构建系统进化树物种信息

续表1 构建系统进化树物种信息

1.4 鲫鱼Ca-VtgAo1 mRNA表达模式分析

分别提取雌性鲫鱼肾脏、卵巢、肝脏、鳃、肠和心脏组织，雄性鲫鱼肾脏、精巢、血液、鳃、肝脏和脾脏组织的RNA，将RNA反转录为cDNA(TaKaRa SYBR Premix ExTaqTM)，以Ca-VtgAo1基因序列为模板设计引物(上游引物：5′-ACCAAGACTTTCACCATCAT-3′，下游引物：5′-GCAGCAAGTTGGTAGCC-3′)，鲫鱼β-actin基因(上游引物：5′-TGCAAGAGGCTGGAGCTCAG-3′，下游引物：5′-TCCTGGCAGTGGCTCAGATC-3′)作为内参，每个样本设计3个平行重复，使用BioRad CFX96TMReal-time PCR检测系统对Ca-VtgAo1mRNA表达模式进行分析。

1.5 数据分析

使用Bio-Rad CFX Manager软件分析溶解曲线，通过2-ΔΔCt分析Ca-VtgAo1mRNA的相对表达水平。采用SPSS 13.0统计软件中的One-way ANOVA对Ca-VtgAo1mRNA在鲫鱼不同组织中相对表达量进行分析，P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 鲫鱼Ca-VtgAo1和Ca-VtgC cDNA序列分析

克隆获得Ca-VtgAo1cDNA序列(GenBank No.:MT409425)全长共有4 241 bp，其中ORF为3 873 bp，编码1 290个氨基酸残基，5′UTR为192 bp，3′UTR为176 bp(图1)。Ca-VtgCcDNA序列全长共有4 207 bp (GenBank No.:MT409426)，其中ORF为3 612 bp，编码1 203个氨基酸残基，5′UTR为150 bp，3′UTR为445 bp(图2)。生物信息学分析预测Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因编码蛋白质的分子质量分别为140.6 ku和134.8 ku，等电点分别为9.00和8.23。SignalP预测分析结果显示，Ca-VtgAo1和Ca-VtgC N端都不具有信号肽序列。SMART分析结果表明，二者具有LPD_N、DUF1943、DUF1944、LvH和LvL结构域，但都不具有β′-C和CT结构域。此外，Ca-VtgAo1具有Pv结构域，且具有5个RXXR位点(RFSR、RTLR、RSSR、RAVR和RLER)(图1、图2)。

1—192碱基序列代表5′UTR，4 066—4 241碱基序列代表3′UTR，193—4 065碱基序列是ORF，*代表终止密码子，下划线部分代表多聚腺苷酸信号AATAAA和LPD_N，方框区域分别代表DUF1943、 DUF1944和蛋白质水解酶切位点，加粗部分代表Pv多聚丝氨酸区域

1—150碱基序列代表5′UTR，151—3 762碱基序列是ORF，*代表终止密码子，下划线部分是LPD_N结构域,方框区域代表 DUF1943和 DUF1944

2.2 Vtg同源比对与系统进化分析

BLASTX分析结果显示，Ca-VtgAo1与鲤鱼(Cyprinuscarpio)VtgB1同源性最高，达到88.62%，其次为鲤鱼(C.carpio)Vtg、格氏鱼(Anabariliusgrahami)Vtg、草鱼(Ctenopharyngodonidella)Vtg1、黑头呆鱼(Pimephalespromelas)Vtg前体、鲮鱼(Cirrhinusmolitorella)VtgB1，同源性分别为88.23%、83.93%、84.27%、83.32%、82.7%。Ca-VtgC与草鱼(C.idella)VtgC同源性最高，达到87.82%，其次为稀有鮈鲫(Gobiocyprisrarus)Vtg3、斑马鱼(Daniorerio)Vtg3、西藏高原鳅(Triplophysatibetana)Vtg，同源性都大于80%，分别为85.55%、82.04%、80.22%。使用MEGA 4.0软件构建系统进化树，结果表明，Vtg主要分为两大支，其中VtgAa和VtgAb、VtgAe和VtgAo分别先聚为一小支，之后这两小支聚为一支，VtgC与VtgABCD聚为一支。Ca-VtgAo1首先与鲫鱼VtgAo2聚为一支，再与其他物种VtgAo聚为一支。Ca-VtgC首先与斑马鱼VtgC聚为一支，再与其他物种VtgC聚为一支(图3)。

图3 鲫鱼Ca-VtgAo1和Ca-VtgC与其他物种Vtg进化分析

2.3 Ca-VtgAo1 mRNA在鲫鱼不同组织中的表达

实时荧光定量PCR结果表明，在雌性鲫鱼中，Ca-VtgAo1mRNA在所检测的组织(肾脏、卵巢、肝脏、鳃、肠和心脏)中均有表达，其中在肝脏组织中的相对表达量最高，在肠、鳃和卵巢中相对表达量较低，在肾脏和心脏中均有极微量的表达(图4A)。与雌性鲫鱼相同，在雄性鲫鱼中，所检测组织(肾脏、精巢、血液、鳃、肝脏和脾脏)中均有Ca-VtgAo1mRNA的表达，且在肝脏组织中的相对表达量最高，但明显低于其在雌性肝脏中的表达量，在雌性肝脏中的相对表达量是雄性的50倍，在肾脏和脾脏中几乎不表达，但在精巢、血液和鳃中的相对表达量较高(血液>鳃>精巢)，血液与肝脏中Ca-VtgAo1mRNA相对表达量相近(图4B)。

不同小写字母表示显著性差异(P<0.05)

3 结论与讨论

3.1 鲫鱼Vtg基因序列及系统进化分析

本研究运用RACE PCR技术首次从鲫鱼肝脏组织中克隆获得2个Vtg cDNA全长序列，生物信息学分析结构结果显示，二者都不具有β′-C和CT结构域，且系统进化树分析结果显示，二者分别与其他物种中VtgAo和VtgC亚型聚为一支，因此，分别命名为Ca-VtgAo1和Ca-VtgC基因。BLASTX 比对结果显示，Ca-VtgAo1基因编码的氨基酸序列与鲤鱼VtgB1同源性最高，达到88.62%，Ca-VtgC基因编码的氨基酸序列与草鱼VtgC同源性最高，达到87.82%，表明本研究成功克隆鲫鱼Ca-VtgAo1和Ca-VtgC全长cDNA序列。Ca-VtgAo1具有富含多聚丝氨酸的Pv结构域，而Ca-VtgC不具有该结构域。系统进化树结果显示，Ca-VtgAo1与其他物种中的VtgAa、VtgAb、VtgAe和VtgAo亚型聚为一支。而Ca-VtgC先与其他鱼类VtgC亚型聚为一支，再与尖端单鳍七鳃鳗VtgABCD聚为一支，表明由于Pv结构域的存在使得Ca-VtgAo1进化速度较Ca-VtgC快，VtgC是较古老的一种卵黄蛋白原亚型。此外，Ca-VtgAo1具有5个RXXR位点，不同Vtg剪切形式具有不同时空表达模式，可以介导不同的生物学功能。

3.2 鲫鱼不同组织Ca-VtgAo1 mRNA表达差异分析

鱼类中存在多种形式Vtg，由于Vtg结构和功能的多样性，不同Vtg亚型具有不同表达模式[30-32]。诸氏鲻虾虎鱼(Mugilogobiuschulae)Vtg-C在肝脏中的相对表达量最高，肠和脾只有微量表达，而在鳃、肌肉、脑和卵巢组织中未检测到其表达[33]。刘春等[31]同样发现，在剑尾鱼中Vtg-C在肝脏中的相对表达量最高，在卵巢、脾和肾脏组织中微量表达，而在鳃、肌肉和脑组织中无表达。而对于Vtg-A，TONG等[33]在青鳉和斑马鱼中发现其只在肝脏中表达，而在其他组织中均未检测到其表达。最新研究发现，在发育至Ⅲ期的雌雄双须骨舌鱼(Osteoglossumbicirrhosum)中，Vtg在雌雄鱼肝脏组织中的相对表达量都最高，在卵巢、精巢中表达量较少，在鳃、脾脏、肾脏、肌肉、心脏、头肾和脑组织中均有极微量的表达[34]。与双须骨舌鱼一致，在古老的石纹电鳐(Torpedomarmorata)卵巢滤泡细胞中可以检测到VtgmRNA和其编码的蛋白质[35]。由于在进化出现硬骨鱼类之前，鲟鱼和软骨鱼是由鳍鱼类分化形成的两支，因此，卵巢表达Vtg是鱼类较古老的一种特征。本研究在雌雄鲫鱼肝脏和雌性卵巢组织中检测到Ca-VtgAo1mRNA表达，且在肝脏组织中的相对表达量最高，表明鲫鱼中Vtg的合成以外源性肝脏组织合成为主，同时还保有古老的Vtg内源性卵巢合成方式。与罗非鱼(Oreochromismossambicus)中Vtg表达模式一致[36]，Ca-VtgAo1mRNA在雌雄鲫鱼肝脏组织中的表达量具有显著差异，其中在雌性肝脏中的相对表达量是雄性肝脏中的50倍，因此，对于性别外部形态特征不明显的鲫鱼，可以依据检测肝脏组织中Ca-VtgAo1mRNA相对表达量的原理开发方便快捷的检测试剂盒来鉴定鲫鱼性别，Ca-VtgAo1基因可以作为一种鉴定鲫鱼性别的分子标记。此外，Ca-VtgAo1mRNA在肠、鳃和血液中少量表达，表明其可能参与了鲫鱼的免疫应答过程。在穆雷彩虹鱼(Melanotaeniafluviatilis)精巢组织中，Vtg主要分布于精细胞周围的细胞间隙中，与输精管周围的结蹄组织相关[37]。在罗非鱼中证明17β-雌二醇通过激活雌激素受体ERα促进Vtg的合成，下调生长激素(Growth hormone,GH)和类胰岛素生长因子(Insulin-like growth factors,IGF)通路[36]，表明精巢中Vtg的作用主要是参与精巢生长抑制、精子-卵子及性别逆转。Ca-VtgAo1mRNA在鲫鱼精巢组织中少量表达，推测其可能也参与了鲫鱼精巢生长发育调控过程。