香菇煮菇水5′-磷酸二酯酶酶解增鲜技术

李顺峰，刘丽娜，王安建，田广瑞，许方方，魏书信

(河南省农业科学院 农副产品加工研究中心，河南 郑州 450002)

香菇(Lentinusedodes)是伞菌目口蘑科一种药食两用的真菌，其味道鲜美、营养丰富，在民间素有“山珍”之称。香菇不仅含有多种营养成分如多糖、蛋白质、氨基酸、维生素及矿物质元素等，还含有双链核糖核酸和水溶性鲜味物质等[1-3]。香菇具有很好的免疫作用[4-6]，它可以提高机体免疫功能、延缓衰老、防癌抗癌、降血压、降血脂、降胆固醇。另外，香菇还对糖尿病、肺结核、传染性肝炎、神经炎、消化不良、便秘等有治疗作用。据中国食用菌协会[7]统计，2018年我国香菇产量为1 043.12万t，其中，河南省香菇产量为288.86万t，位列全国第一。目前，除了干制和鲜销以外，有将近30%的香菇用于加工，而在加工过程中烫漂是必需的工序，会产生大量煮菇水(按年产量的30%计算，每年约有312万t的香菇用于加工，每年产生800～1 400万t的煮菇水)，这些煮菇水含有大量水溶性营养成分，如将这部分煮菇水直接进行排放，则污染环境，也不符合环保要求。如将这部分煮菇水直接进入污水处理系统，又会增加企业污水处理成本，增加企业负担。若能将这些营养成分和呈味成分进行提取利用，做成保健食品、调味品等，不仅可以减少对环境的污染，而且减少企业污水处理成本，提高效益。

目前，对食用菌煮菇水的研究较少，仅有常树人[8]将煮平菇水用于制作平菇母种培养基和俞智明[9]采用煮菇水进行酱油制作的研究。对食用菌煮菇水的营养成分和呈味成分构成及其产品开发鲜见报道。5′-核苷酸是食用菌中的主要呈味物质，主要由核酸分解而成。5′-核苷酸不仅本身具有鲜味，而且和左旋谷氨酸钠(味精)合用具有显著的协同增鲜作用[10-11]，对咸味、酸味、苦味、腥味、焦味有消杀作用[11-14]，还具有提高婴儿免疫调节功能和记忆力的作用[15-16]。因此，以香菇煮菇水为研究对象，采用生物酶解技术提高其呈味物质含量，增强风味，以期为香菇煮菇水的开发利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原材料 香菇煮菇水由河南天中亿龙食品有限公司提供，经纱布过滤后备用。

1.1.2 试剂 5’-磷酸二酯酶(食品级，10 000 U/g，南宁庞博生物工程有限公司)；磷酸二氢钾、高碘酸钠、乙二醇、抗坏血酸、四水合钼酸铵等均为国产分析纯；5′-鸟苷酸(5′-GMP)、5′-腺苷酸(5′-AMP)、5′-肌苷酸(5′-IMP)[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]，5′-黄苷酸(5′-XMP)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；试验用水为蒸馏水。

1.1.3 仪器与设备 FA2004C 型分析天平(上海越平科学仪器有限公司)、THZ-98AB 型恒温振荡器(上海一恒科学仪器有限公司)、UV-1800 型紫外可见分光光度计[岛津仪器(苏州)有限公司]、RV8V-C型旋转蒸发仪[艾卡(广州)仪器设备有限公司]、DF-101S 型恒温磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公司)、艾柯超纯水机(成都康宁实验专用纯水设备厂)、H2050R 型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、Ultimate 3000高效液相色谱仪(戴安中国有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 5′-核苷酸含量的定量测定 5′-核苷酸质量浓度参照陈钧辉等[17]的方法测定。

1.2.1.1 磷标准曲线的绘制 取11支干试管，分别吸取0.1 g/L标准磷溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，加蒸馏水补至2 mL，每管分别加入过碘酸试剂1 mL、30 %乙二醇0.4 mL、2 mol/L的甲胺0.5 mL，摇匀至45 ℃水浴中保温45 min，各管加定磷试剂(17%硫酸∶2.5%钼酸铵∶10%抗坏血酸∶水=1∶1∶1∶2)3.0 mL，继续保温20 min，取出冷却至室温，于660 nm 处测吸光度。以磷含量为横坐标，吸光度为纵坐标制作标准曲线，回归方程为y=0.095 5x+0.004 1(R2=0.999 4)。

1.2.1.2 计算公式 样品中每1 L样液所含5′-核苷酸(g)的计算见公式(1)。

(1)

式中：C为5′-核苷酸质量浓度(g/L)；C1为5′-核苷酸磷的质量浓度(mg/L)；Mr为所测核苷酸相对分子质量，如样品系RNA水解液，则用4种核苷酸的平均相对分子质量,为340；31为磷的相对原子质量；n为样液稀释倍数。

1.2.2 5’-磷酸二酯酶酶解

1.2.2.1 单因素试验 香菇煮菇水浓缩至原体积的1/2，分别在不同pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、酶解温度(50、55、60、65、70 ℃)、加酶量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)和酶解时间(1、2、3、4、5 h)的条件下进行酶解试验，按照1.2.1方法进行5′-核苷酸质量浓度的测定。

1.2.2.2 正交试验 在单因素试验的基础上，对加酶量、酶解时间、pH值和酶解温度4个因素分别选取3个水平，对酶解工艺进行优化。正交试验设计见表1。

1.2.3 呈鲜味氨基酸和呈鲜味核苷酸含量的测定 呈鲜味氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)含量按照食品安全国家标准GB 5009.124—2016测定。

呈鲜味核苷酸含量测定：酶解前后香菇煮菇水经4 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜后进行HPLC分析[1,18]。

表1 正交试验因素与水平

1.2.4 等效鲜味含量(EUC)计算 EUC值常用来表征食品的鲜味程度[19]，具体指在每1 g或1 mL的食物中，以谷氨酸钠(MSG)的量来表示呈鲜物质的总量。

EUC值计算如公式(2)所示：

对于邓强提出的上诉意见，经查，广东省纪委专案组对邓强立案并采取“两规”调查措施之前，省纪委已经掌握其受贿犯罪线索，且邓强在接受调查问话时，开始并没有交代自己的犯罪事实，过了几天才交代，故不构成自首。另外，省纪委事前已掌握肇庆非法采砂及销售有关问题线索，邓强反映的情况对侦破有关案件没有起到实质性作用，因此，邓强的行为也不构成立功。

Y=Σaibi+1 218(Σaibi)(Σajbj)

(2)

式中：Y为EUC值(g/mL)；ai为呈鲜氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)的质量浓度(g/mL)；aj为呈鲜核苷酸[5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-鸟苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)和5′-黄苷一磷酸(5′-XMP)]的质量浓度(g/mL)；bi为呈鲜味氨基酸相对MSG的鲜味程度值(谷氨酸为1，天冬氨酸为0.077)；bj为呈味核苷酸相对5′-IMP的值(5′-IMP=1、5′-GMP=2.3、5′-XMP=0.61、5′-AMP=0.18)；1 218为协同作用常数。

1.3 数据处理

所有试验均进行3次平行试验，测定结果以平均值±标准差(SD)表示，数据分析与整理采用SPSS软件和Excel软件，采用Origin 9.6作图。

2 结果与分析

2.1 酶解单因素试验

2.1.1 pH值对香菇煮菇水5′-核苷酸质量浓度的影响 当加酶量、酶解时间、酶解温度分别为0.2%、3 h、60 ℃时，在不同的pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)进行酶解，研究5’-磷酸二酯酶酶解对香菇煮菇水中5′-核苷酸质量浓度的影响。结果见图1。

由图1可以看出，在试验范围内，pH值由3.0升至5.0时，5′-核苷酸质量浓度逐渐升高，在pH值5.0时，5′-核苷酸质量浓度达到最大(3.19 g/L)，随着pH值继续增大，5′-核苷酸质量浓度呈逐渐下降的趋势，这可能是由于在适宜的pH值作用范围内，酶活性较高，能充分发挥酶的专一水解作用，故选择pH值5.0作为比较适宜酶解的pH值条件。安晶晶等[20]在研究5’-磷酸二酯酶酶解香菇浆时发现，该酶在pH值4.0～5.0时，鲜味核苷酸产量最高，与本研究结果相似。

图1 pH值对香菇煮菇水中5′-核苷酸质量浓度的影响

2.1.2 酶解温度对香菇煮菇水5′-核苷酸质量浓度的影响 在加酶量0.2%、酶解时间3 h、pH值5.0的条件下，分别采用不同酶解温度(50、55、60、65、70 ℃)进行酶解，结果见图2。

图2 酶解温度对香菇煮菇水中5′-核苷酸质量浓度的影响

由图2可以看出，随着酶解温度的升高，5′-核苷酸质量浓度呈先升高后下降的趋势。在酶解温度为55 ℃时，5′-核苷酸质量浓度达到较高水平，当温度继续上升时，5′-核苷酸质量浓度有降低趋势。这是由于在较低温度时，随着温度上升酶活性不断增强，酶解破壁作用加强，但温度超过最适温度之后，随着温度的上升酶部分或全部失活[21-22]，因此，酶解温度确定为55 ℃。

2.1.3 加酶量对香菇煮菇水中5′-核苷酸质量浓度的影响 在酶解时间3 h、pH值5.0、酶解温度55 ℃条件下，分别采用不同加酶量(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)进行酶解，结果见图3。

图3 加酶量对香菇煮菇水中5′-核苷酸质量浓度的影响

由图3可以看出，当加酶量由0.1%增加到0.2%时，5′-核苷酸质量浓度由2.68 g/L显著升高至3.34 g/L，此后继续增大加酶量，5′-核苷酸质量浓度呈缓慢升高趋势。随着加酶量从0.2%升高至0.5%时，5′-核苷酸质量浓度仅比加酶量为0.2%时增加了0.18 g/L，未达到显著水平(P>0.05)。考虑后续工作和节约资源等综合因素，选择加酶量0.2%较为合适。

2.1.4 酶解时间对香菇煮菇水5′-核苷酸质量浓度的影响 在加酶量0.2%、pH值5.0、酶解温度55 ℃条件下，分别采用不同的酶解时间(1、2、3、4、5 h)进行酶解，结果见图4。

图4 酶解时间对香菇煮菇水中5′-核苷酸质量浓度的影响

从图4可以看出，酶解时间在1～3 h，随着酶解时间的增加，5′-核苷酸质量浓度上升较快，酶解时间在3～5 h时，5′-核苷酸质量浓度趋于平稳而不再增加。可见，香菇煮菇水中的底物可在3 h内与5’-磷酸二酯酶充分反应，生成较多的5′-核苷酸。之后，随酶解时间的延长，5′-核苷酸质量浓度不再增加[21-22]。因此，酶解时间确定为3 h。

2.2 酶解正交优化试验

以5′-核苷酸质量浓度为评价指标，对香菇煮菇水中5′-核苷酸的5’-磷酸二酯酶酶解工艺进行优化。正交试验结果见表2。

表2 正交试验设计及结果

从表2中的R值可以看出，各因素对5′-核苷酸质量浓度影响大小依次为A>D>B>C，即影响5′-核苷酸质量浓度的最主要因素是酶解pH值，其他依次为酶解时间、酶解温度和加酶量。从表2中的k值可以看出，5’-磷酸二酯酶酶解提高煮菇水中5′-核苷酸质量浓度的最佳工艺组合为A2B1C3D1，即酶解pH值5.0、酶解温度50 ℃、加酶量0.3%、酶解时间2 h。经试验验证，在此条件下5′-核苷酸质量浓度为3.80±0.07 g/L，与表2第5组无显著差异且酶解温度更低。

2.3 5’-磷酸二酯酶酶解对香菇煮菇水鲜味的影响

5′-核苷酸是5’-磷酸二酯酶对核糖核酸(RNA)的分解产物，包括5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)、5′-胞嘧啶一磷酸(5′-CMP)、5′-鸟苷一磷酸(5′-GMP)、5′-肌苷一磷酸(5′-IMP)、5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和5′-黄苷一磷酸(5′-XMP)，其中，5′-AMP、5′-GMP、5′-IMP和5′-XMP被认为是呈鲜味的核苷酸。酶解前后的香菇煮菇水中呈鲜味核苷酸、氨基酸质量浓度测定结果见表3。由表3可以看出，5’-磷酸二酯酶酶解可显著提高香菇煮菇水呈鲜味核苷酸中5′-AMP和5′-GMP质量浓度(P<0.05)，而对5′-IMP和5′-XMP质量浓度无显著影响(P>0.05)，且酶解对呈鲜味氨基酸质量浓度无显著影响(P>0.05)。

呈鲜味氨基酸与呈鲜味核苷酸存在的协同效应，可以增加蘑菇的鲜味。MAU[23]将蘑菇中呈鲜成分的EUC分为4级，一级>1 000% (>10 g/g)，二级为100%～1 000%(1～10 g/g)，三级为10%～100%(0.1～1 g/g)，四级<10%(<0.1 g/g)。从表3可以看出，按照MAU对EUC的分级标准，酶解前后香菇煮菇水的EUC均为三级，但EUC从酶解前的273.71 g/L显著升高至436.27 g/L，酶解后EUC约为酶解前的1.59倍。

表3 5’-磷酸二酯酶酶解对香菇煮菇水鲜味成分的影响

3 结论与讨论

鲜味作为五大基本味之一，对于食品整体味道及人们对食品的评价至关重要。在5′-核苷酸中，5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP对食品鲜味的贡献最为突出。其中，5′-GMP主要存在于食用菌中，以香菇为例，香菇的鲜味主要来源于呈味氨基酸(以谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、丝氨酸为主)和核苷酸(5′-GMP为主要的呈味核苷酸)。鲜香菇经干制加工后，其中的5′-GMP质量浓度可提升至鲜香菇的3倍，达到1.56 mg/g，可见高温处理可迅速提升鲜味物质的含量[11]。香菇煮菇水是香菇经高温热烫之后得到的溶液，其中的蛋白质会分解转化为小分子的多肽和游离氨基酸，核酸会转化为小分子的5′-核苷酸，鲜味得到大幅度的呈现。采用生物酶法提取制备香菇呈味物质是近年来的研究热点，先后报道有采用纤维素酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶等酶解制备香菇呈味物质[11, 24-26]。本研究表明，通过单因素试验和正交试验优化，5’-磷酸二酯酶酶解香菇煮菇水的最佳工艺条件为酶解pH值5.0、酶解温度50 ℃、加酶量0.3%、酶解时间2 h，在此条件下5′-核苷酸质量浓度3.80 g/L。5’-磷酸二酯酶酶解可显著提高香菇煮菇水中5′-AMP和5′-GMP质量浓度，而对5′-IMP、5′-XMP和呈鲜味氨基酸质量浓度无显著影响，并可显著增强EUC约1.5倍。这一结果与安晶晶等[20]的研究相一致，其在研究5’-磷酸二酯酶对香菇风味基料中鲜味核苷酸酶解增量的影响时，发现经5’-磷酸二酯酶酶解香菇基料的鲜味核苷酸产量提高了3倍。因此，采用5’-磷酸二酯酶酶解香菇煮菇水可显著增强煮菇水的EUC值，呈鲜效果显著，可为香菇煮菇水的高效利用和加工提供技术参考。