木贼-青葙子药对治疗糖尿病视网膜病变作用机制网络药理学研究

2021-03-15李潇然王娟王世东姜淼张华顾浩

中国中医药信息杂志 2021年2期

李潇然，王娟，王世东，姜淼，张华，顾浩

李潇然1，王娟2，王世东1，姜淼2，张华1，顾浩2

1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京 100700

运用网络药理学方法探讨木贼-青葙子药对治疗糖尿病视网膜病变的作用机制。应用TCMSP、ETCM、Uniprot数据库检索木贼和青葙子药物成分及靶点，应用GeneCards、OMIM数据库检索糖尿病视网膜病变基因，通过Venny软件获得交集靶点，利用Cytoscape3.6.1软件构建靶点关系网络，录入String平台构建蛋白相互作用（PPI）网络，并应用RGUI软件对靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。筛选出木贼活性成分10个，青葙子活性成分2个，β-谷甾醇为两药共有成分。获得木贼靶基因295个，青葙子靶基因88个，疾病基因共2702个，疾病-药物交集靶点134个，PPI网络核心靶点为JUN、MAPK1、RELA、AKT1、TNF。GO功能富集分析发现，靶点所在的细胞组分主要为膜区，生物学过程主要富集在脂多糖应答及氧化应激反应，分子功能主要为调节细胞因子活性和调节细胞因子受体结合。KEGG通路富集分析发现，糖基化终末产物通路为核心通路。木贼-青葙子药对治疗糖尿病视网膜病变的作用机制涉及多种复杂的生物学过程，主要作用靶点集中在膜区由糖基化终末产物介导的AGE→RAGE通路中，针对视网膜血管的炎症、坏死、增殖等诸多病理过程。

木贼；青葙子；糖尿病视网膜病变；网络药理学

糖尿病视网膜病变是糖尿病常见的微血管并发症，是导致成年人失明的主要原因之一[1]。糖尿病视网膜病变发病隐匿，早期无明显症状，难以及时发现，后期随着新生血管的破裂出血，导致视力不可逆下降，严重影响患者生活质量。目前西医以降糖、降脂、降压及改善循环等内科治疗为主，配合眼科专科激光治疗[2]，多用于病变早期以延缓疾病进展，对中晚期病变治疗效果差。

糖尿病视网膜病变相当于中医学“消渴病视瞻昏渺”，消渴日久气阴两虚，因虚致瘀，目络瘀阻，在疾病发展过程中可兼有肝气郁结、肝经郁热、痰湿阻滞等证候[3]。国医大师吕仁和教授在糖尿病视网膜病变长期临床诊疗中，在对病、对症及分期的“六对论治”[4]基础上，对出现视物模糊、视力下降患者常加用木贼-青葙子药对，具有一定临床疗效。但目前该药对治疗糖尿病视网膜病变的作用机制尚未阐明。

网络药理学通过药物成分、蛋白、基因靶点的关系网络，研究药物复杂成分在机体中的相互作用机制，特别适合多途径、多靶点的中药药效机制研究。本研究采用网络药理学方法探讨木贼-青葙子药对治疗糖尿病视网膜病变作用机制，为后续研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分筛选

应用TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）、ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/ Index/）数据库检索木贼、青葙子有效成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18为条件筛选木贼、青葙子的活性成分。

1.2 药物作用靶点筛选

在TCMSP、ETCM数据库中检索木贼、青葙子活性成分的潜在靶点。去除重复靶点后，逐一录入Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/），检索人类的靶点蛋白名称（official symbol）及Uniprot ID编号。

1.3 疾病靶点检索

在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/search/advanced/geneMap）数据库中，以“diabetic retinopathy”为检索词进行检索，得到与糖尿病视网膜病变相关的疾病基因。

1.4 药物靶点网络构建

将疾病基因及木贼、青葙子药物靶点分别输入Venny2.1软件（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ index.html），筛选疾病靶点与药物靶点的交集靶点。将交集靶点名称、药物名称及药物成分导入Cytoscape3.6.1软件进行可视化分析，形成药物靶点网络图。

1.5 靶点蛋白相互作用网络构建

将疾病与药物交集靶点录入String11.0平台（https://string-db.org/）构建蛋白相互作用（protein- protein interaction，PPI）网络，蛋白种类设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为“highest confidence”，其他参数保持默认设置，获得PPI网络图。应用RGUI3.61软件，计数所有靶基因连接的靶点数目，取前30位作为核心靶点，制作连接靶点数目的柱状图。

1.6 基因功能及通路分析

应用RGUI3.61软件载入org.Hs.eg.db 3.10.0，将疾病与药物交集靶基因进行匹配并获取entrezIDs，利用RGUI软件及Bioconductor-clusterProfiler3.14工具对交集基因进行GO功能富集分析，包括分子功能（MF）、生物学过程（BP）及细胞组分（CC），限定＜0.01、＜0.05，生成柱状图；利用RGUI软件及Bioconductor-pathview1.26工具进行KEGG通路富集分析，限定检索类型为人类基因，且＜0.01、＜0.05，生成KEGG通路图，再将交集基因标记在通路上。

2 结果

2.1 药物主要活性成分及对应靶基因

筛选得到木贼主要活性成分10个，青葙子主要活性成分2个，其中β-谷甾醇（beta-sitosterol）为两药共有成分，药物活性成分及其OB、DL见表1。通过TCMSP数据库检索药物活性成分作用靶点，去除重复靶点后，共获得木贼作用靶点295个，青葙子作用靶点88个。

2.2 疾病靶点及药物-疾病靶点网络

通过GeneCards、OMIM数据库检索获得糖尿病视网膜病变疾病基因共2702个。将295个木贼靶点、88个青葙子靶点与2702个疾病靶点取交集，共获得疾病-药物交集靶点134个，其中木贼与疾病交集基因132个，青葙子与疾病交集基因30个，三者交集基因28个。将药物名称、药物成分及疾病-药物交集靶点导入Cytoscape3.6.1软件，形成木贼-青葙子药对靶点网络（见图1）。可以看出，前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PIK3CG）、热休克蛋白90-beta（heat shock protein HSP 90-beta，HSP90AB1）等靶基因具有较高的活性成分关联度。内环为共有成分β-谷甾醇对应靶基因，该成分对应包括PTGS2、HSP90AB1、PIK3CG、ADRB2、原癌基因JUN（Jun proto-oncogene，JUN）在内的多个具有较高活性成分关联度的靶点。

2.3 靶点蛋白相互作用网络

将交集靶基因通过String平台构建PPI网络，结果见图2。应用RGUI3.61软件取前30位核心靶点，靶点关联数目柱状图见图3。可以看出，PPI网络的核心靶点为JUN、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen- activated protein kinase1，MAPK1）、转录因子p65（transcription factor p65，RELA）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase 1，AKT1）及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。

图3 木贼-青葙子药对治疗糖尿病视网膜病变核心靶点关联数目（前30位）

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

交集基因GO功能富集分析结果见图4。分子功能中，靶基因在细胞因子活性（cytokine activity）、细胞因子受体结合（cytokine receptor binding）、核受体活性（nuclear receptor binding）方面富集度较高；生物学过程中，靶基因在脂多糖应答（response to lipopolysaccharide）、细菌源分子应答（response to molecule of bacterial origin）及氧化应激反应应答（response to oxidative stress）富集度高；细胞组分中，细胞膜脂筏（membrane raft）、细胞膜微结构域（membrane microdomain）及膜区（membrane region）富集度高。KEGG通路富集分析前10条核心通路见表2。生成AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications的KEGG通路图，并将交集基因标记在通路上，结果见图5。

表2 木贼-青葙子药对治疗糖尿病视网膜病变靶点KEGG通路（前10位）

图5 木贼-青葙子药对核心KEGG通路AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications调控图

2.5 共有成分β-谷甾醇相关靶点KEGG通路

对β-谷甾醇对应的具有较高活性成分关联度的6个靶点PTGS2、HSP90AB1、PIK3CG、ADRB2、JUN、CASP3进行KEGG通路富集分析，限定检索类型为人类基因，且＜0.01、＜0.05，结果得到4条通路，见表3。

表3 β-谷甾醇相关靶点KEGG通路

3 讨论

糖尿病视网膜病变证候特点为本虚标实、虚实夹杂。本虚多为肝肾阴虚、气阴两虚、阴阳两虚，标实多为瘀血阻络、肝气郁结、肝经郁热或痰湿阻滞等[3]。青葙子味苦，性微寒，归肝经，可清肝凉血、明目退翳，《药性论》记载其“治肝脏热毒冲眼，赤障、青盲、翳肿”。木贼味甘苦，性平，归肝、肺经，可散风热、退目翳，《嘉佑本草》记载其“主目疾，退翳膜，消积块，益肝胆，明目”。吕仁和教授临床常以木贼驱散肝胆经风热，佐以青葙子清肝凉血，两者配伍可加强明目退翳功效，用以治疗糖尿病视网膜病变视物模糊、视力下降患者[5]。

从药物靶点网络图可以看出，木贼、青葙子含有共同活性成分β-谷甾醇，其关联靶点在网络中具有较高的活性成分关联度。同时，PPI网络的核心靶点除JUN以外，AKT1、MAPK1、RELA、TNF均未关联β-谷甾醇，仅关联木贼的其他成分，因而推测两者共同活性成分β-谷甾醇并非位于药对治疗机制的核心。对β-谷甾醇成分靶点的KEGG富集分析发现，这些靶点在IL-17信号通路中较高程度富集，该通路为木贼-青葙子药对与疾病相关靶点的第3条核心KEGG通路，在免疫应答及炎症反应方面具有一定作用。由此可见，木贼、青葙子药对在糖尿病视网膜病变治疗中木贼起主要作用，青葙子具有协同增效作用，该协同作用主要表现为共有成分β-谷甾醇在减轻免疫应答及炎症反应方面的作用。另外，青葙子的独有成分豆甾醇（stigmasterol）关联有不同于木贼的独特靶点盐皮质激素受体（NR3C2）、单胺氧化酶a（MAOA），具有调节肾上腺糖皮质激素、肾上腺盐皮质激素及肾上腺髓质激素的作用，对该靶点的研究有助于进一步深入探索两药配伍后疗效互补的作用机制。

GO功能富集分析结果显示，靶点所在的细胞组分主要为膜区，生物学过程主要富集在脂多糖应答及氧化应激反应，分子功能主要为调节细胞因子活性和调节细胞因子受体结合。可见，该药对多作用在参与糖脂代谢、免疫及氧化应激反应的细胞因子上，从而调节众多炎症、增生及坏死的病理过程。

从KEGG通路富集分析图可以看出，靶基因主要富集在由糖基化终末产物（AGEs）介导的AGE→RAGE通路。以AGE-RAGE通路下游激活的PKC→ERK1/2→AP-1通路及PI3K→AKT→NF-κB通路为核心，进而激活转录因子激活蛋白-1（AP-1）、核因子-κB（NF-κB）及其下游众多基因，如转化生长因子-β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）、单核细胞趋化因子-1（MCP-1）、白细胞介素（IL）-6、TNF及黏附分子（ICAM-1、VCAM-1），诱发诸多细胞生物学反应。通路中富集的细胞因子如AKT1、JUN、MAPK1、TNF、RELA等均为PPI网络核心靶点，从侧面印证该通路可能为木贼-青葙子干预糖尿病视网膜病变的重要信号通路。

PKC→ERK1/2→AP-1通路源于蛋白激酶C（PKC）的激活，被认为是参与糖尿病视网膜病变的主要通路之一[6]。PKC激活可增强内皮素-1（ET-1）的表达[7]，ET-1可使视网膜微小血管收缩，导致局部缺血缺氧，诱发血管增生。ET-1可激活细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）[8]，从而激活MAPK级联通路的应激反应。而在MAPK多级激酶的级联反应中，MAPK1、ERK1/2均为重要介导蛋白，参与了多种细胞过程，与糖尿病高血糖应激、氧化应激及糖尿病的慢性并发症的发生密切相关[9]。MAPK级联通路的激活，可间接诱导下游AP-1家族的转录。

PI3K→AKT→NF-κB通路是糖尿病视网膜病变新生血管形成及渗漏的关键通路，该通路的激活加速了病变的发生和发展[10]。本研究核心靶点AKT1是PI3K→AKT→NF-κB通路的核心基因，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）可通过激活Erk1/2进而诱导Akt1表达。周赛君等[11]研究表明，高血糖能显著促进PI3K-Akt通路中关键蛋白AKT的表达，促进猴视网膜新生血管的形成。于佩等[12]研究表明，高糖能通过PI3K-Akt通路增加内皮细胞凋亡。RELA是NF-κB的组成成分之一，AKT1可进一步调控下游RELA蛋白合成转录因子NF-κB。

从AGE-RAGE的KEGG通路图可以看出，AP-1、NF-κB参与了AGE-RAGE通路下游诸多细胞因子通路，诱发细胞生物学反应。其中包括由IL和TNF介导的炎症反应通路、由MCP-1及黏附分子介导的血栓炎症及动脉硬化通路，以及由VEGF介导的新生血管反应通路。

在由IL和TNF介导的炎症反应通路中，AP-1参与了IL-6、IL-8、MCP-1的转录，还可诱导多种自身免疫应答[13]。同时，NF-κB也可调节IL-6、TNF等炎症因子，最终导致周细胞及内皮细胞凋亡，以及动脉粥样硬化的发生。在此炎症反应通路中，TNF参与糖尿病视网膜病变多种生物学过程，可导致视网膜血管通透性增高，和血管内皮细胞增殖[14]，激活小胶质细胞，协同IL-1、IL-6和其他炎性介质诱发炎症反应，激活Caspase家族，最终诱导周细胞及内皮细胞凋亡[15]。有研究表明，IL-6及TNF与动脉粥样硬化密切相关[16]。另外，IL-18可通过PI3K/Akt途径刺激巨噬细胞和内皮细胞分泌IL-1、IL-6和TNF-α，形成炎症反应环[17]，也可最终导致动脉粥样硬化的发生[18]。

在MCP-1及黏附分子介导的血栓炎症及动脉硬化通路中，MCP-1是重要的趋化因子之一。有研究显示，糖尿病视网膜病变患者玻璃体液中MCP-1表达水平显著增高[19]。MCP-1可诱导单核细胞及内皮细胞表达黏附因子，增加细胞黏附，形成血栓，导致局部微循环障碍，近一步损伤视网膜血管，从而使糖尿病视网膜病变加重[20]。

由VEGF介导的新生血管反应通路是研究糖尿病视网膜病变的热门通路之一。VEGF是一种血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，能作用于血管内皮细胞，促使血管内皮细胞增殖，在新生血管生成中起着重要作用。研究表明，糖尿病视网膜病变黄斑水肿患者眼内玻璃体VEGF水平显著升高，与疾病严重程度一致[21]。同时，VEGF可增加黏附分子VCAM-1的表达[22]。Ye等[23]发现，高糖刺激糖尿病大鼠视网膜细胞ERK1/2磷酸化，与AP-1结合后可增加VEGF表达，诱发糖尿病视网膜病变。VEGF介导的新生血管反应通路是晚期糖基化通路AGEs-RAGE通路的重要组成，可造成组织不可逆损伤[24]。

本研究利用网络药理学方法探讨药对配伍机制，但未考虑煎煮炮制过程中新成分产生的情况，药物成分的OB、DL也以单药数据为基础，未考虑炮制过程中的变化。同时，网络药理学基础数据缺乏证候相关的数据，无法探讨证候层面的药物机制。有待今后更多的药物炮制研究及证候药理研究的开展。

综上所述，在木贼-青葙子药对治疗糖尿病视网膜病变的作用中，木贼发挥主要作用，青葙子起一定的协同增效作用。该协同作用主要表现在二者共有成分β-谷甾醇在减轻免疫应答及炎症反应方面的作用。该作用机制涉及多种复杂的生物学过程，主要作用靶点集中在膜区由糖基化终末产物介导的AGE→RAGE通路中，尤以AGE-RAGE通路下游激活的PKC→ERK1/2→AP-1通路及PI3K→AKT→NF-κB通路为主，进而激活AP-1、NF-κB及其下游TGF-β1、VEGF、MCP-1、IL-6、TNF等诸多细胞因子，产生视网膜血管的炎症、坏死、增殖等病理过程，最终导致周细胞及内皮细胞凋亡、动脉粥样硬化发生及新生血管形成。本研究结果有待今后实验研究进一步证实。

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Study on Mechanism of Equiseti Hiemalis Herba-Celosiae Semen Pair for Diabetic Retinopathy Based on Network Pharmacology

LI Xiaoran1, WANG Juan2, WANG Shidong1, JIANG Miao2, ZHANG Hua1, GU Hao2

To investigate mechanisms of Equiseti Hiemalis Herba - Celosiae Semen pair in treating diabetic retinopathy (DR) based on network pharmacology.The main active components and targets of Equiseti Hiemalis Herba and Celosiae Semen were obtained by TCMSP, ETCM and Uniprot Database. The diabetic retinopathy genes were collected by GeneCards and OMIM database. After that, the common targets were obtained through Venny software, and component-target network map was constructed using Cytoscape3.6.1 software. Protein-protein interaction network (PPI) was constructed by String website. Finally, RGUI software was used to complete GO function and KEGG pathway enrichment analysis of the targets.Ten active components of Equiseti Hiemalis Herba and 2 active components of Celosiae Semen were screened out, including β-sitosterol, a common component of both herbs. In addition, 295 targets related with Equiseti Hiemalis Herba, 88 targets related with Celosiae Semen, 2702 target genes related with DR, and 134 disease-drug intersection targets were obtained. JUN, MAPK1, RELA, AKT1, and TNF were core targets of PPI network. GO enrichment analysis found that the cell component where the targets were located was mainly the membrane area, the biological process was mainly enriched in the lipopolysaccharide response and oxidative stress response, and the molecular function was mainly to regulate cytokine activity and regulate cytokine receptor binding. KEGG enrichment analysis found that the glycation end products pathway was the core pathway.The mechanism of Equiseti Hiemalis Herba - Celosiae Semen pair for DR involves a variety of complex biological processes, and the main target is concentrated in the AGE→RAGE pathway mediated by advanced glycosylation end products in the membrane area, targeting many pathological processes such as inflammation, necrosis, and proliferation of retinal blood vessels.

Equiseti Hiemalis Herba; Celosiae Semen; diabetic retinopathy; network pharmacology

R259.872；R285.5

1005-5304(2021)02-0028-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005585