云南木瓜紫米酒活性成分含量的测定分析

（墨江地道酒业有限公司，云南普洱 654800）

地道云南木瓜紫米酒是以墨江县优质紫米酿制而成的优质白酒为基础酒，加以切片后木瓜浸泡、贮存、过滤、调配等一系列工艺配制而成。按产品分类属于配制酒[1]。墨江紫米营养丰富，有补血、健脾、理气等药用价值[2]，木瓜具有滋补健胃、舒筋活络等功效[3]。配制酒的保健功能和独特风味越来越受消费者的喜爱，因此，本研究旨在综合开发利用墨江紫米和木瓜，并按蒸馏酒及其配制酒生产卫生规范[4]进行了3 批次的木瓜紫米酒预生产调试试验，并拟对其产品进行质量控制研究。目前针对配制酒的活性成分研究主要以挥发性成分研究报道较多[5]，浸泡物成分的研究仍有研究空间。本研究以木瓜中的芦丁、绿原酸、槲皮素、没食子酸、水杨酸为指标成分[6-7]，参考惠小娜等[8]的研究方法，建立了以UPLC-MS/MS 法测定了新产品地道云南木瓜紫米酒中芦丁、绿原酸、槲皮素、没食子酸、水杨酸的含量，以期为该产品的标准制定和质量控制提供参考、为该产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

1.1.1 材料

酒样：3批地道云南木瓜紫米酒（均为开发研究试制产品，厂家：墨江地道酒业有限公司，批号：20181110A、20190315A、20190412A）。

1.1.2 试剂

试剂及耗材：水杨酸对照品（批号：110742-201220，纯度：99.1 %）、绿原酸对照品（批号：110753-201716，纯度：99.3%）、芦丁对照品（批号：100080-201610，纯度：91.9 %）、没食子酸对照品（批号：110831-201605，纯度：90.8 %）均购自中国食品药品检定研究院，槲皮素对照品（批号：100081-200907，纯度：96.5 %）购自中国食品药品检定所；甲醇（色谱纯，美国Fisher 公司），甲酸（色谱纯，美国Tedia 公司），实验室用水为Mili-Q 超纯水（德国Merck 公司）。

1.1.3 仪器设备

1290 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司），G6430 三重串联四级杆质谱仪（美国Agilent 公司），XS205DU 十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler 公司），3-18KS 高速台式冷冻离心机（德国SIGMA 公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 对照品溶液制备

精密称取芦丁、绿原酸、槲皮素、没食子酸、水杨酸对照品适量，加50%甲醇分别制成0.937 mg/mL、1.095mg/mL、0.975mg/mL、1.082mg/mL、1.105mg/mL、1.079 mg/mL、0.822 mg/mL、1.002 mg/mL、1.061 mg/mL贮备液。分别取各对照品溶液适量，置于同一100 mL容量瓶中，用50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，即得芦丁、绿原酸、槲皮素、没食子酸、水杨酸的混合对照品溶液，质量浓度分别为1.950 μg/mL、31.11 μg/mL、0.2120 μg/mL、2.190 μg/mL、1.914 μg/mL。

1.2.2 供试品溶液制备

取地道云南木瓜紫米酒适量于PE 管中，置离心机中，10000 r/min 离心10 min 后，取上清液经0.22 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

1.2.3 空白样品溶液

取紫米酒基酒，按“1.2.2”方法制备空白样品溶液。

1.2.4 仪器测试条件

色谱条件：Agilent SC-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm,1.8 μm）；流动相：水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱（0～3 min，10 %B；3～4 min，10%→30%B；4～5 min；30%→50%B；5～7 min，50 %→70 % B；7～10 min，90 % B；10～11 min，90%→10%B），流速为0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

质谱条件：采用电喷雾负离子电离源模式（Electronic spray ion,ESI-），扫描方式为多反应监测（multiple reaction monitoring,MRM），雾化气压力：30 psi，干燥气温度：300 ℃，干燥气流速：9 L/min，毛细管电压为3500 V，MRM 模式定量。5 种活性成分的电离方式、分子量、母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 色谱和质谱条件优化

本试验考察了甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、0.1 % 甲酸乙腈-水等流动相条件，发现0.1%甲酸乙腈-水条件下各组分均可以得到较好的分离和峰形；质谱条件进行优化发现，ESI 负离子扫描模式下5 种活性成分响应值均优于ESI 正离子模式，因此本试验选择在ESI 负离子扫描模式下确定各成分母离子及其解簇电压（DP），然后找出特定子离子，优化得到最佳碰撞能（CE），最后在MRM 模式下优化各成分的质谱参数，优化所得质谱条件使各成分均显示出较高的检测灵敏度。优化所得5 种活性成分UPLC-MS/MS 色谱图分离度良好、峰形均较好、空白样品无干扰。结果见图1。

表1 5种待测活性成分质谱条件

2.2 线性关系、定量限和检测限

精密量取“1.2.1”项下混合对照品溶液适量，采用倍数稀释法，用50%甲醇分别稀释2 倍、5 倍、10倍、20 倍、100 倍、200 倍，制得6 个不同浓度梯度的系列溶液，按“1.2.4”项条件下分别进样测定3 次，记录峰面积。以对照品待测液浓度（x）为横坐标，峰面积平均值（y）为纵坐标，进行回归，再将混合对照品溶液逐步稀释，分别以信噪比S/N=10、S/N=3 时的质量浓度作为定量限和检测限，结果见表2，各成分在各自范围内线性关系良好。由检出限和定量限结果可以看出，本方法灵敏度较高。

2.3 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号20181110A），于室温下放置0、2 h、6 h、12 h、24 h 后在“1.2.4”项条件下进样测定，根据芦丁、绿原酸、槲皮素、没食子酸、水杨酸色谱峰面积计算RSD，分别为2.37%、0.66%、2.78 %、2.23 %、1.16 %。结果表明，该供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4 重复性试验

图1 多反应监测模式下5种活性成分UPLC-MS/MS色谱图

表2 5种成分的回归方程、线性范围、相关系数、LOQ 和LOD

取同一批样品（20181110A），按“1.1.2”方法制备供试品溶液6 份，在“1.2.4”项条件下进样测定，测得地道云南木瓜紫米酒中芦丁、绿原酸、槲皮素、没食子酸、水杨酸含有量计算RSD，分别为1.31%、1.18%、3.46%、2.26%、1.33%。结果表明，该方法重复性良好。

2.5 加样回收率和精密度试验

分别精密取0.1 mL 混合对照品溶液各6 份，于40 ℃氮气吹干，分别精密加入同批次含有量已知的地道云南木瓜紫米酒（20181110A）10 mL，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，在“1.2.4”项条件下进样测定，计算回收率和精密度。5 种活性成分的平均回收率分别为芦丁99.8 %、绿原酸95.6 %、槲皮素102.4 %、没食子酸101.2 %、水杨酸104.3 %，结果均在95.6 %～104.3 %。结果表明，该方法回收率良好，可用于准确测量；RSD 分别为2.31 %、2.87 %、4.69 %、3.12 %、2.96 %，均在2.31 %～4.69%。结果表明，该方法精密度良好。

2.6 样品含有量测定

取不同批号地道云南木瓜紫米酒3 批，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，在“1.2.4”项条件下进样测定，计算含有量，结果见表3。所测3 批地道云南木瓜紫米酒试制产品中，绿原酸含量最高，各批次间5 个成分的RSD 在0.94%～8.92%，各批次各成分含量较稳定。

3 结论

地道云南木瓜紫米酒丰富了墨江紫米和木瓜的精深加工产品，对推动墨江紫米产业的发展有促进作用，并可给当地带来一定的经济效益。本试验经方法学考察验证，建立了UPLC-MS/MS 法同时测定地道云南木瓜紫米酒中芦丁、绿原酸、槲皮素、没食子酸、水杨酸的含有量，该方法简便快速、专属性强、灵敏度高，为地道云南木瓜紫米酒质量控制及产品质量标准的制定奠定基础，为进一步开发利用该产品提供了理论依据。

表3 样品测定结果(μ g/L，n=3)