基于微波辅助水浴法的双孢蘑菇多糖的提取、 分离及纯化研究

白海娜

（吉林化工学院，吉林吉林 132022）

双孢菇也被称为圆蘑菇、白蘑菇或者洋蘑菇，为低温性的菇类，因同时生长出两个孢子而被命名。双孢菇是目前世界范围内栽培规模最大、总产量最大、单位栽培面积产量最高、栽培技术现代化程度最高的食用菌种，也是我国目前栽培最广泛、产量最大的食用菌种。真菌是营养成分较为丰富的物质，一直深受人们的喜爱。真菌多糖能够增强人体的免疫功能、延缓衰老、抗癌、美容，因此受到人们的一致好评，具有较为广阔的市场发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：市售双孢菇，烘干粉碎，过80目筛，备用。试剂：糖样品、蒸馏水、氯化钠溶液、氢氧化钠溶液、浓硫酸和重蒸酚。

1.2 仪器与设备

FW100型高速粉碎机、TGL-16C型离心机、WD800G型微波炉、HH-4型恒温水浴锅、AR1530/C型电子天平、RE-52AA型旋转蒸发仪、电热恒温鼓风干燥箱、DS型循环水式真空泵、TU-1810DS型紫外可见分光光度计、冷冻干燥机及离子交换柱、变色硅胶干燥器、容量瓶、烧杯、比色管和通风橱等[4]。

1.3 实验方法

1.3.1 单因素实验

（1）多糖提取。双孢菇干粉适量，按照料液比均匀混合，进行微波辅助水浴法处理，微波功率设置为560 W，提取液上离心机以4 000 r/min为条件离心15 min，对上清液多糖含量进行测定[1]。浓缩上清液后加入浓缩液3倍体积的C2H5O（乙醇）溶液，常温条件下析出棕色絮状的粗多糖，上离心机以 4 000 r/min为条件离心15 min，收集沉淀，冷冻干燥后得到粗多糖。

（2）多糖含量测定。取2 g双孢菇多糖，按照上述提取实验操作提取双孢菇多糖提取液，取上清液0.5 mL，分别加入5%的苯酚溶液1 mL、浓硫酸 5 mL，摇匀后置于40 ℃的水浴中，经过30 min的加热和10 min的冷却，测定波长490 nm处的吸光度，采用葡萄糖标准曲线回归方程式来计算提取液中的多糖含量[2]。计算公式为：

式中：m1为多糖的质量，g；m2为双孢菇的干粉质量，g。

（3）单因素实验设计。取双孢菇样品，磨成粉末并按照不同配比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40）（1∶50和1∶60）制成料液，进行单因素实验。本次实验共测定不同料液比、微波时间、提取时间对双孢菇多糖得率的影响。

1.3.2 双孢菇多糖分离纯化

（1）DEAE Sephadex A-25分 离 纯 化。DEAE Sephadex A-25经预处理后装柱，取适量多糖样品放入容器，并加入蒸馏水，配成4 mg/mL多糖溶液，取3 mL上柱。收集洗脱液共160管，每管5 mL，其中蒸馏水40管、氯化钠溶液（0.1 mol/L）40管、氯化钠溶液（0.3 mol/L）40管、氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）40管。并利用苯酚-硫酸法测定多糖吸光值[5]。

（2）多糖纯度测定。①紫外光谱扫描。取适量多糖样品制成水溶液，并在200～400 nm下进行扫描。②多糖纯度鉴定。将洗脱后的多糖溶液稀释成2 mg/mL溶液，取2 mL上Sephadex G-200柱，以氯化钠溶液（0.1 mol/L）为流动相，流速每分钟 0.5 mL，对多糖纯度进行检测。

2 结果分析

2.1 单因素分析

2.1.1 微波时间对双孢菇多糖得率的影响

取相同配比料液6份，以相同功率进行超声处理，时间分为为10 s、20 s、30 s、40 s、50 s和60 s，并在相同温度下提取相同时间后，经离心处理后提取6份上清液，测定多糖得率结果如图1所示。由图1可知，多糖得率随着微波时间的增加而先升后降。微波时间处于40 s时能够获得最多的多糖，随着时间的增加，双孢菇的细胞会加剧破碎，释放更多的多糖。

图1 微波时间对多糖得率的影响

2.1.2 料液比对双孢菇多糖得率的影响

取不同配比料液共6份，料液比（g/mL）分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60。所有料液以相同功率进行相同时间的超声处理，并在相同温度下提取相同时间后，经离心处理后提取6份上清液，测定多糖得率结果如图2所示。由图2可知，多糖得率随着溶剂的用量增多而出现先上升后下降趋势。料液比在1∶40（g/mL）时能够获得最多的多糖。料液比过大会导致体系的流动性降低，无法进行多糖提取。料液比过小会降低体系的反应速率[3]。因此最佳料液比是1∶40（g/mL）。

图2 料液比对多糖得率的影响

2.1.3 提取时间对双孢菇多糖得率的影响

取相同配比料液6份，以相同功率进行相同时间的超声处理，并在同一提取温度下分别提取1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h和4 h后，经离心处理后提取6份上清液，测定多糖得率结果如图3所示。由图3可知，多糖得率随着提取时间的增加而先增后减。提取时间在3 h时能够获得的多糖最多。

图3 提取时间对多糖得率的影响

2.2 双孢菇多糖的分离纯化

2.2.1 DEAE-Sephadex A-25柱层析纯化

通过DEAE-Sephadex A-25对双孢菇多糖溶液样品进行分离纯化，并利用自动收集器分部收集，采用苯酚-硫酸法对所有样品进行逐一检测，洗脱结果如图4所示。

图4 双孢菇多糖DEAEDEAE-SephadexA-25柱层析洗脱曲线

由图4可知，利用蒸馏水、氯化钠溶液 （0.1 mol/L）、氯化钠溶液（0.3 mol/L）和氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）洗脱过程中，均存在吸收峰值，且相较于氢氧化钠溶液（0.1 mol/L）、氯化钠溶液 （0.3 mol/L），蒸馏水、氯化钠溶液（0.1 mol/L）洗脱物质量更大。因此，本研究以这两组样品为主要研究对象，将这两个洗脱组分分别收集，并进行醇沉处理，最后通过离心沉淀及冷冻干燥处理，得到两种产物：①A-25-1为淡黄色粉末；②A-25-2为浅褐色粉末。

2.2.2 双孢菇菇柄多糖纯度鉴定

取A-25-1、A-25-2样品各10 mg，分别融于含10 mL蒸馏水的容器中，并将其置于紫外-可见分光光度计下进行扫描，结果如图5所示。

图5 A-25-1、A-25-2紫外可见光扫描结果

由图5可知，在260 nm、280 nm处，A-25-1、A-25-2紫外扫描均为发现峰值，这表明双孢菇多糖经分离纯化后已没有蛋白质、核酸等杂质。

3 结论

（1）本次研究以微波辅助水浴法进行双孢菇多糖提取实验，并通过单因素实验测定了料液比、微波时间、提取时间对双孢菇多糖提取的影响，结果表明双孢菇多糖最佳提取时间为3 h，最佳料液比为1∶40，最佳微波时间为40 s。

（2）双孢菇多糖经DEAE-SephadexA-25柱层析纯化后，蒸馏水、氯化钠溶液（0.1 mol/L）洗脱物质量更大，且利用紫外光扫描后发现并无蛋白质、核酸等杂质。