HPLC-FLD法测定油茶籽油中苯并(a)芘的含量

唐后乐

（邵阳学院，湖南邵阳 422000）

油茶籽受到高温焙炒,特别是压榨过程又受到高温、高压的作用,就会产生苯并(a)芘[Benzo (a) Pyrene，B(a)P ]，它是一种多环芳烃（PAHs）类化合物，对人体有着较大影响，过量摄入有可能致癌[1-2]。为保障人们的身体健康，应对油茶籽油制备检测精准度提出较高要求，从而获取准确的苯并(a)芘含量数据[3]。油茶籽油制备流程较为复杂，且制备过程中易受多种因素的干扰，加大了苯并(a)芘检测难度[4]。本文尝试选取LC-PAHs专用液相色谱柱作为制备处理工具，提出一种HPLC-FLD法检测方案。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶籽脱酸油、浸提油茶籽毛油、压榨油茶籽毛油，采用自制方式获取；不同种类的品牌市售油茶籽油，编号1～8，采购于沃尔玛超市；丙酮、乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲醇，均为色谱纯（AR），由Tedia公司提供。

本研究短期观察结果显示，MSDAR和PETD均能有效治疗青少年腰椎间盘突出症。在严格把握手术适应证、熟练掌握技术的前提下，MSDAR安全可靠有效，尤其对于椎间盘退变等级为Ⅲ级的LDH患者，行纤维环缝合可提高术后髓核“再水化”，有助于促进患者腰椎功能恢复。但本研究样本量较小，随访时间较短，远期两组患者疗效仍有待观察。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；LC-PAHs色谱柱（25 cm×4.6 mm，5 μm），美国Supeleo；配荧光检测器，美国安捷伦公司；固相萃取装置，美国 Supeleo；TDL-80-2B型离心机，上海安亭科学仪器厂；碱性氧化铝柱，博纳艾杰尔科技；HiCapt Benzo型固相萃取柱，维泰克科技（武汉）有限公司；弗罗里柱，德国Simon Aldrich；C18柱，博纳艾杰尔科技；Turbo VapO LV型氮气吹扫装置，美国Biotage；硅胶柱，德国Simon Aldrich。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的制备

（3）固相萃取洗脱剂的用量。为了确定更为精准的固相萃取洗脱剂用量，本实验在B(a)P标准工作液上样过柱，而后对其采取洗脱处理。其中，洗脱剂的添加量为5 mL，分5次洗脱，每次洗脱用量 1 mL。操作过程中，控制洗脱速度，要求耗时70 s完成一次洗脱。分别检测每洗脱一次后的B(a)P回收率，并记录检测结果。

1.3.2 样品前处理

上海市于2015年6月出台了《关于进一步推进本市社区卫生服务综合改革与发展的指导意见》，推行由1家社区卫生服务中心、1家区级医院和1家市级医院组成的“1+1+1”组合，为签约糖尿病居民提供分级诊疗服务[5]。

（2）样品净化。选取真空固相萃取装置作为净化工具，按照以下4个操作步骤，对样品采取净化处理。①样品活化处理。以固相萃取柱作为实验器皿，向其中添加丙酮、正己烷，用量分别为5.2 mL、 2.2 mL，搅拌均匀，使得器皿内环境得以活化。②上样。将第一步提取的2 mL上层溶液加入器皿中，控制流速1 mL/min。③淋洗。取3 mL正己烷和乙酸乙酯，按照体积为4∶1的比例混合，利用此部分混合液淋洗固相萃取柱，而后弃去淋洗液，并抽干小柱。④用3 mL丙酮洗脱样品，控制洗脱流速2.1 mL/min。将所有样品洗脱液收集起来，放置在50 ℃环境中，以氯作为媒介吹干样品，向器皿中添加0.5 mL甲醇，采用涡旋方式处理，使得样品得以溶解，完成定容操作，形成1 mL样品，将其装入样瓶中，等待检测。

为了提高实验检测结果精准度，本次实验对仪器的使用条件进行了限定，同时对检测器的作业参数进行了设置。本实验采用专用液相色谱柱LC-PAHs创造色谱柱实验条件，控制进样量为10 μL，保持柱温恒定在30 ℃左右。按照1∶1的配比，将水和乙腈混合在一起，注入器皿中，控制流速1.0 mL/min。关于检测器作业参数的设定，按照国家测定标准，设置作业波长为324 nm，激发波长270 nm，检测作业时间29 min。

1.3.3 苯并(a)芘检测方法

（1）B(a)P固相萃取柱的选取。本次实验选取4种固相萃取柱作为实验装置，包括HiCapt Benzo固相萃取柱、佛罗里硅土柱、C18柱、碱性氧化铝柱。以浓度为10 μg/L的B(a)P甲醇溶液作为实验材料，用量0.5 mL，吸附在不同类型固相萃取柱上，重复3次操作，采用与前文相同的方法采取洗脱处理，完成固相萃取柱丙酮洗脱，经过浓缩定容后，转移到检测仪器上。通过观察仪器上B(a)P的吸附效果，给出相应判断。按照本实验方案设计的正己烷的萃取用量、净化上样用量，对实际回收率进行调整，计算如下：

式中：M0为空白样品测定值；μg/kg；M1为加标样品测定值；μg/kg；Z为加标量；μg/kg。

2.1.1 B(a)P固相萃取柱

取1ml的B(a)P标液，向其中加入甲醇，将其稀释成1mg/L的标准储备溶液，冰箱中4 ℃下密封 保存[5]。

1.3.4 色谱条件

从回归分析结果看，可决系数为0.6579，调整后的可决系数,达到0.6389，说明所建模型整体上对样本数据拟合较好，同时，在95%的置信度水平下LnFIR系数通过了t统计检验，表明深圳市金融资产规模对经济增长有显著性影响；LnFIR与LnGDP之间的相关系数为3.9810，说明LnFIR与LnGDP之间存在高度的正相关。由此可以证明，金融支持与经济发展之间的关系是正相关的，金融的发展会推动经济的发展，符合理论分析中金融支持对经济发展的促进作用。

2.1.2 固相萃取洗脱剂

(3) 液压振动：利用液压力作为振动的能量来源，相比于机械振动和超声波振动，液压振动的振幅可以更大，振动的精度更加精确。

2 结果与分析

2.1 苯并(a)芘检测方法的确定

（2）固相萃取洗脱剂的选取。实验选择4种洗脱溶剂作为实验材料，包括甲醇洗脱剂、二氯甲烷洗脱剂、丙酮洗脱剂、乙腈洗脱剂，利用这4种洗脱剂，完成固相萃取柱洗脱处理，检测B(a)P的回收率。实验中，控制其他参数保持不变。

我得说，坐拥保时捷911 Carrera RS 2.7只要有钱就行，但要想充分发挥它所蕴藏的潜力，绝非是一件易事。如果你能拥有Röhrl Walter的驾驶技术，那也没有问题，毕竟他早在40多年前就和这辆特殊的保时捷融为一体了。虽然，以今天的标准来衡量这辆身价奇高的保时捷，它各方面都显得有些松松垮垮的了。

按照1.3.2（1）中方法测定B(a)P固相萃取柱回收率结果如下：①HiCapt Benzo固相萃取柱添加洗脱剂为丙酮，加标量为10.5 μg/L，测得固相萃取柱回收率为（92.30±0.45）%；②佛罗里硅土柱添加洗脱剂为丙酮，加标量为10.5 μg/L，固相萃取柱回收率为（85.65±0.77）%；③C18柱添加洗脱剂为二氯甲烷，加标量为10.5 μg/L，固相萃取柱回收率为（88.43±0.45）%；④碱性氧化铝柱添加洗脱剂为二氯甲烷，加标量为10.5 μg/L，固相萃取柱回收率为（53.60±1.55）%。

检测结果显示，本实验选取的4种固相萃取柱的吸附回收率数值差异较为显著（p＜0.05），由此可以判断，固相萃取柱的类别对B(a)P的吸附作用差异显著。另外，通过对比4种固相萃取柱的吸附回收率数值，HiCapt Benzo数值最大，回收率为（92.30±0.45）%。所以，应该选择HiCapt Benzo作为B(a)P固相萃取柱。

在水泥水化放热过程中，放热速度与放热最高峰时释放出来的热量，会对水泥水化反应过程的进度产生重要的影响[2]。一般来讲，温度升高会促进水泥的水化反应，而水化反应的加快会进一步放出热量，这样会导致混凝土的内外温差大，最终因为热胀冷缩而产生裂缝。裂缝对混凝土强度和密实度的影响很大，并最终影响到工程的整体结构安全和使用功能。所以，控制水泥的水化速度至关重要。

观察比较干预前后的空腹血糖、餐后2小时血糖以及糖化血红蛋白（hba1c）变化情况，糖尿病知识掌握情况，服药依从性和生活方式改善情况。

测试结果显示，甲醇洗脱剂应用下B(a)P的回收率为72.56%，二氯甲烷洗脱剂应用下B(a)P的回收率为90.01%，丙酮洗脱剂应用下B(a)P的回收率为92.54%，乙腈洗脱剂应用下B(a)P的回收率为76.08%。

与乙腈洗脱剂、甲醇洗脱剂相比，甲醇洗脱剂和二氯甲烷洗脱剂应用下B(a)P的回收率更高，优势更为显著。由此可以推断，这两种洗脱剂对B(a)P的洗脱影响更大。由于二氯甲烷自身基质容易遭受干扰，不利于得到准确的检测结果。因此，丙酮是最佳洗脱剂。

（1）提取样品。采用称量的方式，从样品中提取部分油茶籽油样品，重量为0.5 g，将此部分样品放置于聚丙烯离心管中，器皿容积为50 mL。向器皿中加入正己烷，用量3.1 mL，采用涡旋方式混合两部分样品，持续时间70 s。向器皿中添加超纯水，用量2.2 mL，继续采用涡旋方式混合两部分样品，持续时间70 s，按照4 000 r/min速度离心，持续180 s。提取溶液中的上层溶液，提取量为2 mL。

2.1.3 固相萃取洗脱剂

检测结果显示，丙酮洗脱体积为1 mL时，B(a)P回收率为52.29%±1.93%aA；丙酮洗脱体积为2 mL时，B(a)P回收率为73.60%±1.05%aB；丙酮洗脱体积为3 mL时，B(a)P回收率为92.23%±0.59%aC；丙酮洗脱体积为4 mL时，B(a)P回收率为92.04%±0.59%aC；丙酮洗脱体积为5 mL时，B(a)P回收率为91.94%±0.95%aC（大写字母代表差异极显著，p＜0.05，小写字母代表差异显著，p＜0.01）。

上述检测结果中，与丙酮1～2 mL用量相比，使用3～5 mL丙酮洗脱时，B(a)P回收率差异显著性较强（p＜0.01）。当丙酮用量达到3 mL时，回收率出现了明显增加，而后随着用量的增加，回收率并没有出现增加变化趋势，而是开始小幅度下降，并且回收率变化差异显著性较差（p＞0.05）。3～5 mL丙酮洗脱对B(a)P回收率影响较小，从环保角度出发应尽可能减少丙酮用量，所以3 mL用量为最佳。综上检测分析，最佳苯并(a)芘检测方法：选取HiCapt Benzo作为固相萃取柱，利用丙酮完成固相萃取柱洗脱，控制用量为3 mL。

4.在领用材料的生产制作过程中存在串料、替代料使用的现象，且在过程中没有留下相应的信息轨迹，导致无法归集至相应成本对象。

2.2 精炼程度不同条件下油茶籽油B(a)P加标回收率的测定

本实验选取浸提油茶籽毛油、压榨油茶籽毛油、市售某品牌油茶籽油、油茶籽脱酸油作为样本，设置样本数量为6份，分别将这些样本放入聚丙烯离心管（容积25 mL）中。设置空白对照组3份，实验组3份，即每一种样本拆分为两部分，其中3份添加B(a)P标准工作液，用量500 μL（10 μg/L），振荡摇匀，而后放在检测仪上，获取B(a)P加标回收率，并计算加标样品平均检测值，结果如表1所示。

表1 精炼程度不同条件下油茶籽油B(a)P加标回收率测定结果

目前，应用比较多的B(a)P加标回收率检测方法为反相高效液相色谱法，利用该方法检测到的油茶籽油B(a)P含量（回收率）均值为93.2%，而本文提出的检测方法，测得4种油茶籽油中B(a)P回收率均超过了93.2%。其中，压榨油茶籽毛油的B(a)P回收率达到了104.49%。由此看来，本文提出的检测方法得到的B(a)P回收率较高。另外，当前应用比较多的氧化铝活度测定法，加标量相同情况下得到的样品平均检测值为（8.838±0.497）μg/kg，该数值明显低于本文提出的检测方法。本次检测中，样品平均检测最小值为（8.871±0.076） μg/kg。因此，本文提出的B(a)P检测方法实际应用价值较高。

2.3 8种油茶籽油中苯并(a)芘含量的检测

采用与实验2相同的检测方法，选取8种不同的样品，均为品牌市售油茶籽油，每种样品准备6份，每一种样本拆分为两部分，设置空白对照组3份，实验组3份。每份样品单独放入聚丙烯离心管（容积25 mL）中，向装有实验组样品的器皿中添加B(a)P标准工作液，用量500 μL（10 μg/L），振荡摇匀，而后放在检测仪上，获取苯并(a)芘含量数据，同时检测未添加B(a)P标准工作液的样品苯并(a)芘含量，结果如表2所示。两种方法下产生的8种品牌油茶籽油中苯并(a)芘含量检测结果差异较小，相比之下，国标检测方法应用下得到的苯并(a)芘含量更高。从整体来看，本文提出的检测方法在稳定性能方面具备较大优势，可以得到比较精准的检测结果，不易受外界因素干扰，与当前已经取得的研究成果相比，该检测方法更贴近正确数值，可作为油茶籽油中苯并(a)芘检测工具。

表2 两种检测方法下油茶籽油中苯并(a)芘含量检测结果对比表（单位：μg/kg）

4 结论

本文围绕油茶籽油中苯并(a)芘检测方法展开研究，针对传统检测方法存在的不足，提出一种基于HPLC-FLD法的检测方法。该方法利用LC-PAHs专用液相色谱柱作为主要实验装置，通过合理选取固相萃取柱种类、固相萃取洗脱剂种类，确定最佳洗脱剂用量，形成完整的苯并(a)芘检测方法。精炼程度不同条件下油茶籽油B(a)P加标回收率测定、8种油茶籽油中苯并(a)芘含量检测结果显示，本文提出的B(a)P检测回收率较反相高效液相色谱法的B(a)P回收率更高，并且较氧化铝活度测定法的加标量相同情况下得到的样品平均检测值更高，更加贴近正确数值，具有较高的应用价值。