长链非编码RNA RPPH1靶向miR-143-3p在非小细胞肺癌中的作用机制

薛国亮，张 聪，郑桂丽，王 俊

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，约占癌症总死亡的18.4%[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lunch cancer，NSCLC）是肺癌中最常见的病理类型。虽然近年来肺癌的诊疗技术有所发展，但是5 年生存率仍然不高[2]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一类没有开放阅读框的序列高度保守且不编码蛋白的类信使RNA转录本[3]。既往研究显示，LncRNA 通过调控微RNA（microRNA，miRNA）参与癌症的发生和发展[4-5]。核糖核酸酶P RNA 组分H1（ribonuclease P RNA component H1，RPPH1）是新发现的lncRNA，在细胞生长、分化和凋亡中发挥重要作用[6]，与中枢神经系统损伤[7]、糖尿病肾病[8]和肿瘤[9]等疾病有关。RPPH1 在人体组织中广泛表达，可参与结直肠癌[9]、乳腺癌[10]、白血病[11]和食管鳞癌[12]等的进展。既往少有研究报道RPPH1 在肺癌中的作用及其机制。miR-143-3p 在NSCLC 中表达下调，能够抑制癌细胞的增殖、侵袭和迁移[13]。本研究分析RPPH1 通过miR-143-3p 对NSCLC 细胞的增殖和凋亡的影响，旨在探讨RPPH1 在NSCLC 发生和发展中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器

NSCLC 细 胞Calu-3 和肺腺 癌A549 细 胞以及正常人支气管内皮细胞HBE 均购自上海复祥生物科技有限公司。RPMI 1640 培养液和胎牛血清购自上海语纯生物科技有限公司，LipofectAMINETM2000 试剂购自美国Sigma 公司。特异性针对RPPH1 的shRNA（shRPPH1）和阴性对照（negative control，NC）shRNA（shNC）、miR-143-3p-抑制子（inhibitor）、miR-143-3p-模拟物（mimics）以及携带有RPPH1 的重组质粒pcDNA3.1-RPPH1 均购自山东维真生物科技有限公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒、反转录试剂盒、2×SYBR Green PCR Mastermix 试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒和SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒均购自上海联迈生物工程有限公司。凋亡检测试剂盒购自上海语纯生物科技有限公司。引物均由广州伯信生物科技有限公司设计并提供。鼠抗人细胞周期蛋白B1（cyclin B1）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、Bax、剪切型（cleaved）-caspase 3 和GAPDH（内参照）单克隆抗体均购自英国Abcam 公司，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠IgG 抗体（二抗）购自美国Sigma 公司。

1.2 组织样本

选取2018 年6 月—2019 年10 月由山东第一医科大学第一附属医院收治的35 例NSCLC 患者手术切除的肺癌组织及其癌旁组织（距离癌组织≥5 cm）。患者术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗。所有患者均签署知情同意书。本研究已获得本院伦理委员会批准。

1.3 实时荧光定量PCR 法检测组织和细胞中RPPH1 的表达水平

采用TRIzol 法提取组织和细胞中的总RNA，并通过反转录试剂盒制备获得cDNA，随后用实时荧光定量PCR 试剂盒进行PCR 扩增。反应条件：95 ℃ 30 min；94 ℃ 15 s、55℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共40 个循环。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行，用2-△△Ct法计算RPPH1 的相对表达量。RPPH1 上游引物序列为3’-CGAGCTGAGTGCGTCCTGTC-5’，下游引物序列为3’-TCGCTGGCCGTGAGTC TGT-5’；U6（内参照）上游引物序列为5’-AT TGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物序列为5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；miR-143-3p 上游引物序列为5’-AACATTCA TTGCTGTCGGTG-3’，下游引物序列为5’-GC TGTCAACGATACGCTACGT-3’。

1.4 细胞转染

使用LipofectAMINETM2000 试剂盒将特异性针对RPPH1 的shRNA（shRPPH1 组）及阴性对 照shNC（shNC 组）转 入Calu-3 和A549 细胞，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。首先制备LipofectAMINETM2000 复合物和DNA 复合物（每孔加入4 μL 浓度为1 μg/μL的重组质粒和246 μL 无血清培养液），随后将2 者混匀，温室静置20 min。将混合物加入6 孔板中，温室培养6 h 后更换为含血清的培养液，继续培养48 h。转染24 h 后进行后续实验。shRPPH1 序列为5’-GGACAACGCCGGUUAUGAA-3’，shNC 序列为5’-GC CAGCACCATGCTCTTCTA-3’。随后采用实时荧光定量PCR 法检测细胞中RPPH1 的表达水平，方法同1.3 节。

1.5 克隆形成实验和CCK-8 法检测细胞的增殖能力

克隆形成实验：使用胰蛋白酶消化转染后的Calu-3 和A549 细胞，以5×104个/孔的密度接种于6 孔板中，细胞分组及处理同1.4 节；将各组细胞置于37 ℃、CO2体积分数为5%培养箱中继续培养3 周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。用4%多聚甲醛溶液固定细胞，30 min后用结晶紫染色，光学显微镜下计算克隆数。

CCK-8 法：细胞的分组及处理同克隆形成实验，待细胞培养24、48、72 和96 h 时，在每个培养孔中加入10 μL CCK-8 试剂，于酶联免疫检测仪波长490 nm 处检测各组细胞的D值。

1.6 FCM 法检测细胞的凋亡率

将转染后的Calu-3 和A549 细胞制成1×106个/mL 的悬液，细胞分组及处理同1.4 节。异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的Annexin Ⅴ（Annexin Ⅴ-FITC）/ 碘化丙啶（propidium iodide，PI）用500 μL 预冷的1×结合缓冲液稀释后配制成工作液，随后加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混匀后孵育10 min；再加入2.5 μL PI，孵育5 min。最后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 蛋白质印迹法检测细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达水平

收集各组细胞（细胞分组及处理同1.4 节），用RAPI 裂解液提取细胞中的总蛋白，并用BCA试剂盒检测蛋白浓度。取适量蛋白，行10%SDS-PAGE 分离蛋白，并将分离后的蛋白用半干转移法转移至PVDF 膜上。随后，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭处理2 h，加入一抗[鼠抗人cyclin B1（体积稀释比例为1 ∶500）、PCNA（体积稀释比例为1 ∶200）、Bax（体积稀释比例为1 ∶500）、cleaved-caspase 3（体积稀释比例为1 ∶500）和GAPDH（内参照）（体积稀释比例为1 ∶500）单克隆抗体]，4 ℃反应过夜孵育，次日除去一抗；用TBST 缓冲液洗涤3 次，加入二抗[HRP-羊抗鼠IgG（工作液体积稀释比例为1 ∶1 000）]，温室反应1 h。加入电化学发光剂后，在发光仪下进行蛋白成像。应用Image J 软件分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参照GAPDH 蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.8 RPPH1 与miR-143-3p 靶向关系的预测和鉴定

应用miRNA 靶向预测软件TargetScan 进行检索，发 现RPPH1 与miR-143-3p 有互补结合位点。采用双荧光素酶报告基因实验确定2 者的靶向关系。将RPPH1 突变型（mutanttype，MUT）荧光酶报告载体（PGLO-RPPH1-MUT）、野生型（wild-type，WT）荧光素酶报告载 体（PGLO-RPPH1-WT）、miR-143-3p-模拟物（miR-143-3p-mimics）和阴性对照模拟物（NC-mimics）两两组合后共转染入细胞中，检测荧光素酶活性。

为进一步验证RPPH1 与miR-143-3p 的靶向关系，首先采用脂质体转染法将NC-mimics（对照组）、miR-143-3p-mimics 和miR-143-3pinhibitor 分别转入Calu-3 和A549 细胞，转染流程同1.4 节。采用实时荧光定量PCR 法检测各组细胞中RPPH1 的表达水平，检测流程同1.3 节。随后，采用脂质体法将空载体pcDNA3.1（对照组）以及重组载体pcDNA3.1-RPPH1，shNC（对照组）和shRPPH1 分别转入Calu-3 和A549 细胞中，转染流程同1.4 节，同样采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中miR-143-3p 的表达水平，检测流程同1.3 节。

1.9 调控RPPH1 和miR-143-3p 表达对细胞增殖和凋亡的影响

将Calu-3 和A549 细胞均分为3 组：shNC+NC-mimics 组、shRPPH1+NC-mimics 组 和shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 组。按组别，采用脂质体转染法将shNC、shRPPH1、NCmimics（作为miR-143-3p-mimics 和miR-143-3pinhibitor 的共同对照）和miR-143-3p-inhibitor分别转入Calu-3 和A549 细胞中，转染流程同1.4节。随后，采用实时荧光定量PCR 法检测细胞中miR-143-3p 的表达水平（方法同1.3 节），克隆形成实验和CCK-8 法检测各组细胞的增殖能力（方法同1.5 节），FCM 法检测各组细胞的凋亡能力（方法同1.6 节），最后采用蛋白质印迹法检测增殖和凋亡相关蛋白的表达水平（方法同1.7 节）。

Fig.1 The expression levels of long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1(RPPH1) in 35 non-small cell lunch cancer (NSCLC) tissues and their adjacent tissues,NSCLC cells (Calu-3 and A549) and normal human bronchial endothelial HBE cells (as the control) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.*P＜0.05,vs HBE cells (n=4).图1 实时荧光定量PCR 法检测RPPH1 在NSCLC 组织和细胞中的表达水平

1.10 统计学方法

应用SPSS 20.0 统计学软件处理所有的实验数据。所有实验均独立重复4 次，计量资料以表示。采用独立样本t检验或配对t检验以及采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RPPH1 在NSCLC 组织和细胞中的表达水平

实时荧光定量PCR 检测结果（图1）显示，NSCLC 组织中RPPH1 的相对表达量为2.39±0.58，明显高于癌旁组织的0.93±0.45（P＜0.001）。Calu-3 和A549 细胞中RPPH1 的相对表达量分别为3.78±0.54 和2.77±0.47，明显高于HBE 细胞的1.04±0.19，（P均＜0.001）。这一结果提示，RPPH1 可能参与NSCLC 的发生。

2.2 RPPH1 对细胞增殖和凋亡的影响

实时荧光定量PCR 法检测结果（图2A）显示，在Calu-3 细胞中，shRPPH1 组的RPPH1 相对表达量为0.27±0.08，低于shNC 组的0.96±0.20（P＜0.05）；在A549 细胞中，shRPPH1 组 的RPPH1 相对表达量为0.31±0.09，低于shNC组的0.95±0.17（P＜0.001）。这一结果提示，shRPPH1 能有效沉默Calu-3 和A549 细胞中RPPH1 的表达水平。

CCK-8 法检测结果（图2B）显示，48、72 和96 h 时，在Calu-3 和A549 细胞中，shRPPH1 组细胞的增殖能力均低于shNC 组（P均＜0.05）。

Fig.2 The effects of long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1 (RPPH1)silencing on cell proliferation and apoptosis of non-small cell lunch cancer (NSCLC) cells (Calu-3 and A549).A: The expression levels of RPPH1 in Calu-3 and A549 cells transfected with shRNA targeting RPPH1 (shRPPH1) were detected by real-time fluorescence quantitative PCR;B-C: The proliferation abilities of Calu-3 and A549 cells after RPPH1 silencing were detected by CCK-8 method (B) and colony formation test (C);D: The apoptotic rates of Calu-3 and A549 cells after RPPH1 silencing were detected by flow cytometry (FCM).Calu-3 and A549 cells were transfected with shRNA negative control (NC) (shNC)as the controls.*P＜0.05,vs shNC group (n=4).图2 沉默RPPH1 表达对NSCLC Calu-3 和A549 细胞增殖和凋亡的影响

克隆形成实验检测结果（图2C）显示，在Calu-3 细胞中，shRPPH1 组细胞的克隆数为（51.00±14.12）个，低于shNC 组的（100.23±38.73）个（P＜0.05）；在A549 细胞中，shRPPH1 组细胞的克隆数为（42.37±12.18）个，低于shNC 组的（107.15±41.72）个（P＜0.05）。

FCM 法检测 结果（图2D）显 示，在Calu-3 细胞中，shRPPH1 组细胞的凋亡率为（16.78±3.71）%，高于shNC 组的（6.08±1.27）%（P＜0.05）；在A549 细胞中，shRPPH1 组细胞的凋亡率为（15.01±3.43）%，高于shNC 组的（5.14±1.87）%（P＜0.05）。

蛋白质印迹法检测结果（图3）显示，在Calu-3 细胞中，shRPPH1 组 中cyclin B1 和PCNA 蛋白的相对表达量分别为0.47±0.09和0.43±0.07，均低于shNC 组的0.91±0.15和1.12±0.17（P均＜0.001）；shRPPH1 组 中Bax 和cleaved-caspase 3 蛋白的相对表达量分别为0.88±0.09 和1.21±0.10，均高于shNC 组的0.48±0.09 和0.37±0.06（P均＜0.001）。在A549 细胞中，shRPPH1 组中cyclin B1 和PCNA 蛋白的相对表达量分别为0.37±0.12 和0.55±0.11，均低于shNC 组 的0.83±0.08 和1.04±0.11（P均＜0.001）；shRPPH1 组中的Bax 和cleaved-caspase 3 蛋白相对表达量分别为1.01±0.11 和1.20±0.16，均高于shNC 组的0.63±0.07 和0.58±0.06（P均＜0.001）。

Fig.3 The expression levels of cell proliferation and apoptosis-related proteins [cyclin B1,proliferating cell nuclear antigen (PCNA),Bax and cleaved-caspase 3] in Calu-3 and A549 cells transfected with shRNA targeting long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1 (RPPH1) were detected by Western blotting.Calu-3 and A549 cells were transfected with shRNA negative control (NC) (shNC) as the controls.*P＜0.05,vs shNC group (n=4).图3 蛋白质印迹法检测沉默RPPH1 表达对细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

2.3 验证RPPH1 靶向miR-143-3p

TargetScan 预测到RPPH1 和miR-143-3p 具有结合位点（图4A）。双荧光素酶报告基因检测结果（图4B）显示，miR-143-3p-mimics 可以明显抑制PGLO-RPPH1-WT 的荧光素酶活性，而miR-143-3p-inhibitor 可以增强PGLO-RPPH1-WT 的活性（P均＜0.05）。

实时荧光定量PCR 检测结果（图4C）显示，转入miR-143-3p-mimics 后可使miR-143-3p 表达水平上调，继而下调RPPH1 的表达水平；而转入miR-143-3p-inhibitor 后可使miR-143-3p 表达水平下调，继而上调RPPH1 的表达水平（P均＜0.05）。同时，实时荧光定量PCR 检测结果（图4D）显示，转入重组载体pcDNA3.1-RPPH1 可上调RPPH1 的表达水平，继而下调miR-143-3p的表达水平；而转入shRPPH1 可下调RPPH1 的表达水平，继而上调miR-143-3p 的表达水平（P均＜0.05）。

上述结果提示，RPPH1 可以靶向作用于miR-143-3p。

Fig.4 The targeting relationship between long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1 (RPPH1) and microRNA (miR)-143-3p.A: The binding sites of RPPH1 and miR-143-3p were analyzed by TargetScan.B: The targeting relationship between RPPH1 and miR-143-3p was identified by double luciferase reporter gene system.*P＜0.05,vs NC-mimics group (n=4).C: The expression levels of RPPH1 in Calu-3 and A549 cells transfected with miR-143-3p-mimics or miR-143-3p-inhibitor were detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Calu-3 and A549 cells were transfected with NCmimics as the control.*P＜0.05,NC-mimics (n=4).D: The expression levels of miR-143-3p in Calu-3 and A549 cells transfected with recombinant plasmid pcDAN3.1-RPPH1 or shRPPH1 were detected by realtime fluorescence quantitative PCR.Calu-3 and A549 cells were transfected with empty vector pcDAN3.1 or shNC as the control groups.*P＜0.05,vs pcDAN3.1;ΔP＜0.05,vs shNC (n=4).图4 RPPH1 与miR-143-3p 靶向关系的验证

2.4 调 控RPPH1 和miR-143-3p 的表达 对Calu-3 和A549 细胞增殖和凋亡的影响

克隆形成实验检测结果（图5A）显示，Calu-3 细胞中shNC+NC-mimics 组克隆形成数为（109.67±21.98）个，shRPPH1+NC-mimics组为（40.12±10.09）个，shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 组为（103.65±33.78）个；与shNC+NC-mimics 组相比，shRPPH1+NC-mimics 组细胞的克隆形成能力受到明显抑制（P＜0.05）；与shRPPH1+NC-mimics 组相比，shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 组细胞的克隆形成能力明显增强（P＜0.05）。A549 细胞中shNC+NCmimics 组克隆 形成数 为（96.07±15.52）个，shRPPH1+NC-mimics 组 为（41.78±10.14）个，shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 组 为（90.67±20.03）个；与shNC+NC-mimics 组相比，shRPPH1+NC-mimics 组细胞的克隆形成能力受到明显抑制（P＜0.05）；与shRPPH1+NC-mimics 组相比，shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 组细胞的克隆形成能力明显增强（P＜0.05）。这一结果提示，沉默RPPH1 表达后，Calu-3 和A549 细胞的克隆形成能力受到明显抑制，而再抑制miR-143-3p 表达后能够提高Calu-3 和A549 细胞的克隆形成能力。

CCK-8 法检测结果（图5B）显示，96 h 时shNC+NC-mimics 组Calu-3 细胞的D值 为1.29±0.16，转染shRPPH 后（shRPPH1+NCmimics 组）D值降至0.65±0.05（P＜0.05）；而同时转染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor后，D值上升 至1.24±0.06（P＜0.05）。96 h时shNC+NC-mimics 组A549 细胞的D值 为1.32±0.05，转染shRPPH 后（shRPPH1+NCmimics 组）D值降至0.75±0.10（P＜0.05）；而同时转 染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，D值上升至1.29±0.10（P＜0.05）。这一结果提示，沉默RPPH1 表达后，Calu-3 和A549 细胞的增殖能力均受到明显抑制，而再抑制miR-143-3p 表达后能够提高Calu-3 和A549 细胞的增殖能力。

Fig.5 The cell proliferation and apoptotic rate of Calu-3 and A549 cells transfected with shRNA targeting long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1 (RPPH1) (shRPPH1) or shRPPH1+microRNA (miR)-143-3p were detected by colony formation assay (A),CCK-8 assay (B) and FCM method (C),respectively.Calu-3 and A549 cells were transfected with shRNA negative control (NC)(shNC) +NC-mimimcs as the control.*P＜0.05,vs shNC+NC-mimics group;ΔP＜0.05,vs shRPPH1+NCmimics group (n=4).图5 RPPH1 靶向miR-143-3p 对细胞增殖和凋亡的影响

FCM 法检测结果（图5C）显示，shNC+NC-mimics 组Calu-3 细胞凋 亡率为（4.83±1.34）%，转染shRPPH 后（shRPPH1+NC-mimics 组）细胞凋亡率升高至（15.11±2.10）%（P＜0.05）；而同时转染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，细胞凋亡率下降至（3.95±1.67）%（P＜0.05）。shNC+NC-mimics 组A549 细胞凋亡率为（3.24±0.90）%，转 染shRPPH后（shRPPH1+NC-mimics 组 ）升高至（13.02±1.21）%（P＜0.05）；而同时转染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，细胞凋亡率下降至（3.69±1.11）%（P＜0.05）。这一结果提示，沉默RPPH1 表达后Calu-3 和A549 细胞的凋亡能力均明显增强；而抑制miR-143-3p表达后，Calu-3 和A549 细胞的凋亡能力均明显受到抑制。

Fig.6 The expression levels of cell proliferation-related protein [cyclin B1 and proliferating cell nuclear antigen (PCNA)] and apoptosis-related protein (Bax and cleaved-caspase 3] in Calu-3 and A549 cells transfected with shRNA targeting long non-coding RNA (LncRNA) ribonuclease P RNA component H1(RPPH1) were detected by Western blotting.Calu-3 and A549 cells were transfected with shRNA negative control (NC) (shNC) as the control.*P＜0.05,vs shNC+NC-mimics group;ΔP＜0.05,vs shRPPH1+NCmimics group (n=4).图6 蛋白质印迹法检测RPPH1 靶向miR-143-3p 对细胞增殖和凋亡相关蛋白的影响

蛋白质印迹法检测结果（图6）显示，shNC+NC-mimics 组Calu-3 细胞中cyclin B1 和PCNA蛋白的相对表达量分别为0.90±0.13 和0.98±0.07，凋亡相 关蛋白Bax 和cleaved-caspase 3的表达量分别为0.23±0.04 和0.67±0.09；转染shRPPH 后（shRPPH1+NC-mimics 组 ），cyclin B1 和PCNA 的表达量分别下调至0.45±0.12 和0.37±0.08，而Bax 和cleaved-caspase 3的表达量分别上调至1.00±0.12 和1.21±0.18（P均＜0.05）；同时转 染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，cyclin B1 和PCNA 的 表达量分别上调至0.93±0.15 和1.01±0.09，而Bax 和cleaved-caspase 3 的表达量分别下调至0.34±0.08 和0.68±0.10（P均＜0.05）。shNC +NC-mimics 组A549 细胞中cyclin B1 和PCNA 蛋白的相对表达量分别为0.92±0.14 和0.97±0.10，Bax 和cleaved-caspase 3 的表达 量分别为0.41±0.09 和0.61±0.10；转染shRPPH后（shRPPH1+NC-mimics 组），cyclin B1 和PCNA 的表达量分别下调至0.34±0.09 和0.41±0.05（P均＜0.05），Bax 和cleaved-caspase 3 蛋白的表达量分别上调至0.98±0.11 和1.03±0.14（P均＜0.05）；同时转染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后，cyclin B1 和PCNA 的表达 量分别上调至0.95±0.10 和1.02±0.12，Bax 和cleaved-caspase 3 的表达量分别下调至0.52±0.06和0.59±0.09（P均＜0.05）。

上述结果提示，转染shRPPH1+NCmimics 后，Calu-3 和A549 细胞的增殖能力以及增殖相关蛋白cyclin B1 和PCNA 的表达水平均明显下调，而细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Bax 和cleaved-caspase 3 的表达水平均明显上调；共转染shRPPH1+miR-143-3p-inhibitor 可通过下调miR-143-3p 的表达水平而逆转上述效应。这一结果提示，shRPPH1 可负调控miR-143-3p 的表达水平，从而促进NSCLC 细胞的增殖并抑制其凋亡。

3 讨论

LncRNA 是一种非编码RNA，存在于所有生命形式中，在心血管系统、神经系统、生殖系统和内分泌系统疾病中均发挥重要作用[14]。越来越多的研究表明，LncRNA 在NSCLC 的发生和发展中发挥重要作用[15-17]。RPPH1 是新发现的LncRNA，本研究结果显示RPPH1 在NSCLC组织和细胞中的表达水平较高，这与WU 等[16]报道的结果一致，提示RPPH1 可能参与NSCLC的发生。细胞增殖和细胞凋亡是影响肿瘤进展的重要因素，而RPPH1 又与之密切相关[6,12]。本研究发现，下调RPPH1 的表达可以抑制Calu-3细胞和A549 细胞的增殖，并促进细胞凋亡，说明RPPH1 可能参与了NSCLC 的进展。

RPPH1 是核糖核酸酶P 的一个RNA 亚单位，在细胞的生长、分化、凋亡和周期调控中均发挥重要作用[6]，与中枢神经系统损伤[7]、糖尿病肾病[8]和肿瘤[9]等疾病有关。RPPH1 在肿瘤中的作用机制目前尚未明确。LIANG 等[9]发现，RPPH1 可以通过与TUBB3 基因相互作用，促进外泌体介导的巨噬细胞发生M2 型极化，进而促进结直肠癌细胞的转移。LncRNA 靶向调控miRNA 是其发挥作用的重要途径。有报道显示，下调RPPH1 可以抑制miR-122 的表达，进而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭[10]。类似地，LEI 等[11]也发现RPPH1 能够通过miR-300-5-p 促进急性粒细胞性白血病细胞的增殖、侵袭和迁移。

本研究前期通过TargetScan 预测到RPPH1与miR-143-3p 存在结 合位点。miR-143-3p 在NSCLC 中的作用及其机制既往已有大量报道。miR-143-3p 可能通 过VASH1[18]、MAPK7[19]和FOSL2[20]等信号通路发挥作用。为证实RPPH1对miR-143-3p 的靶向调控作用，本研究首先利用了双荧光素酶报告基因实验进行验证，随后发现转染shRPPH1 以及阴性对照后，Calu-3 和A549 细胞增殖能力明显下降以及cyclin B1 和PCNA 蛋白的相对表达量明显降低，而细胞凋亡率以及Bax 和cleaved-caspase 3 蛋白的相对表达量明显增加；而共转染shRPPH1 和miR-143-3p-inhibitor 后可逆转上述效应。上述结果说明，PPH1 可能通过靶向miR-143-3p 促进NSCLC的进展。

综上所述，本研究证实RPPH1 可能通过负调控miR-143-3p 而参与NSCLC 的发生和发展，提示RPPH1/miR-143-3p 轴可能成为NSCLC 潜在治疗靶点。本研究仍存在一定的局限性，例如未分析RPPH1 与NSCLC 临床病理特征、疗效和预后的关系，同时未检测miR-143-3p 下游基因的变化。因此，未来需要进一步开展动物学和临床上的研究，以明确RPPH1 在NSCLC 中的作用机制及意义。