无创产前基因检测在血清学筛查风险值异常及高龄孕妇中的应用*

景亚玲， 刘晓芳,2， 陈俭辉， 赵连芳**， 赵咏梅

(1.遂宁市中心医院 产前诊断中心实验室， 四川 遂宁 629000； 2.遂宁市中心医院 产科， 四川 遂宁 629000)

有研究报道，胎儿染色体异常占出生缺陷遗传学病因的80%以上，常见类型有21-三体(唐氏综合征)、18-三体(爱德华综合征)及性染色体异常等，此类患儿大都伴有轻中度、甚至严重的智力障碍或结构畸形[1-2]，目前尚无有效的方法治疗该病，只能通过产前检查尽早发现并及时终止妊娠来避免胎儿的出生。血清学筛查可以从一般孕妇人群中筛查出胎儿罹患18-三体或21-三体风险较高的孕妇[3]，而高龄孕妇由于其卵细胞质量下降、生殖功能减退、生殖细胞或受精卵易发生染色体畸变或不分离等，导致胎儿染色体异常发生率较高，此类孕妇大多行羊水穿刺分析胎儿染色体核型，但羊水穿刺属于有创检测技术，存在误伤胎儿、致畸、流产、宫内感染等风险[4]。无创产前基因检测(non-invasive prenatal testing，NIPT)由于简便、无创，并且对21、18、13号等染色体非整倍体异常的筛查具有较高的灵敏度、特异性及阳性预测值，越来越多的孕妇选择先行NIPT检测，如果NIPT阳性者再行介入性产前诊断[5]。本文旨在通过比较孕妇先行NIPT检测(阳性者再行羊水穿刺)与直接行羊水穿刺间的胎儿染色体异常检出情况，探讨NIPT检测在血清学筛查风险值异常孕妇及高龄孕妇中的临床应用价值。现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

统计2018年1月—2019年12月接受遗传咨询的血清学筛查风险值异常及高龄的单胎孕妇检查的情况，以自愿选择先行NIPT检测、结果异常者再行羊水穿刺进行胎儿染色体核型分析的孕妇作为NIPT组，以直接选择羊水穿刺进行胎儿核型分析的血清学筛查风险值异常孕妇及高龄孕妇作为羊水穿刺组。血清学筛查风险值异常包括：血清学筛查临界风险、21-三体(T21)高风险及18-三体(T18)高风险，设定T21和T18高风险切割值(Cut Off)分别为1 ∶270和1 ∶350，大于Cut off值为高风险，风险值在Cut off 值到1 ∶1 000 的孕妇为临界风险。孕妇预产期年龄≥35岁的归为高龄孕妇。所有检查者均严格签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1无创产前检测方法及诊断标准 采集孕妇静脉血10 mL，离心分离血浆、提取血浆游离DNA、构建文库、文库定量、BerryGenomics/Illumina NextSeq CN 500高通量测序机测序及数据分析，计算出13、18、21三条染色体和其它染色体Z值[6-7]。利用Z值评估样本的风险值，Z为-3<～<3判定为非整倍体低风险， ≥3判定为非整倍体高风险；NIPT结果提示异常者行羊水穿刺及胎儿核型分析，对NIPT低风险孕妇详细解释检测结果及意义。

1.2.2羊水穿刺及核型分析 在无菌条件下，超声引导定位抽取羊水20 mL，均分为2管，1 800 r/min 离心12 min，留取细胞悬液1.5 mL，采用平行法双线，分别接种于加有GBICO培养基3 mL的2个培养瓶中，置于37℃培养箱培养7 d、换液、转种，10 d左右根据细胞生长情况收取细胞。经秋水仙碱终止羊水细胞生长、物理法刮取羊水细胞、低渗、预固定、固定、再固定、滴片、烤片、胰酶消化及 Giemsa 染色制备羊水染色体片，经蔡司 Axio Imager Z2 全自动染色体扫描分析仪扫片，每个标本至少分析8个核型，计数30个分裂相，有异常核型需增加分析和计数的个数。根据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016)》对所检染色体进行命名，本研究未统计染色体正常变异的核型结果。

1.2.3对妊娠或新生儿结局进行随访 采用多种方式对所有研究对象妊娠或新生儿结局进行随访。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 染色体异常检出情况

结果显示，NIPT组共纳入1 198例，包括血清学筛查临界风险546例、21-三体高风险160例、18-三体高风险5例及高龄孕妇487例；其中17例NIPT提示异常，经羊水穿刺后确诊胎儿染色体核型(表1)；羊水穿刺组共纳入1 253例，包括血清学筛查临界风险105例、21-三体高风险515例、18-三体高风险65例及高龄孕妇568例，其中33例核型异常(表2)。

表1 NIPT组17例NIPT异常的胎儿染色体核型及妊娠结局Tab.1 The karyotype and pregnancy outcome of 17 fetuses with abnormal NIPT in NIPT group

表2 羊水穿刺组33例核型异常胎儿的穿刺孕周、检查指征及染色体核型Tab.2 Gestational age at puncture, examination correction, and chromosome karyotypes of 33 cases of fetus with abnormal karyotype in amniocentesis group

2.2 随访及染色体异常检出率

结果显示，NIPT 低风险的孕妇，其胎儿出生3个月后的随访暂未发现异常病例；在血清学筛查临界风险、21-三体高风险、18-三体高风及高龄指征2组孕妇的染色体异常检出率比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)。见表3。

表3 NIPT组与羊水穿刺组的染色体异常检出率Tab.3 Comparison of the detection rates between NIPT and amniocentesis groups

3 讨论

血清学筛查风险值异常不仅可以提示怀有18-三体或21-三体胎儿的风险增高，还可以提示开放性神经缺陷、宫内发育迟缓和流产等的风险增加[8-9]；由于婚育观念的改变和计划生育政策的变化，我国高龄孕妇明显增多[10]，而高龄会导致胎儿染色体异常发生率增高[11]，所以临床工作中要注意这两大类群体的进一步产前检查。当临床医生建议临界风险孕妇先行 NIPT 检测异常者再行羊水穿刺，血清学筛查高风险孕妇及高龄孕妇直接行羊水穿刺术，孕妇出于紧张、焦虑和恐惧等自身原因，会出现临界风险孕妇愿意直接做羊水穿刺确诊胎儿染色体，但也有血清学筛查高风险孕妇和高龄孕妇不愿或有介入性产前诊断禁忌症而不适行羊水穿刺术的情况。

血清学筛查临界风险孕妇为 NIPT 的适用人群[12]。在充分知情同意情况下，本研究的651名临界风险孕妇中，567名孕妇选择先行 NIPT，只有7名孕妇NIPT提示异常(1.23%)需要接受侵入性产前诊断。由于孕周不适宜再等待、想要准确率更高的检测、追求“一步到位”等多种原因，另外的105名(16.13%)临界风险孕妇选择直接行羊水穿刺确诊胎儿染色体核型，最终检出21-三体2例(1.90%)，在临界风险孕妇的 NIPT 组与羊水穿刺组的检出率差异无统计学意义(P>0.05)，表明对于临界风险孕妇先行 NIPT 检查可以显著减少孕妇接受有创性产前诊断的例数。

研究表明血清学筛查高风险可以提示21三体和18-三体以外的其他多种染色体异常，如环状染色体、易位染色体等[13-15]，所以血清学筛查高危孕妇如果仅行 NIPT 检测而不行羊水穿刺，可能会存在漏诊除染色体数目异常外的其它染色体异常类型的风险[12]。本研究有160名21-三体高风险孕妇及5名18-三体高风险孕妇选择先行 NIPT，只有1例提示性染色体异常，后经羊水穿刺诊断为45,X；其余515名21-三体高风险孕妇和65名18-三体高风险孕妇孕妇选择直接羊水穿刺，检出19例孕妇胎儿染色体有异常。且在2种高风险孕妇的 NIPT 组与羊水穿刺组的检出率间差异均无统计学意义(P> 0.05)，表明 NIPT 在血清学筛查高风险人群已具有十分良好的表现，NIPT 可以降低由于筛查高风险而接受介入性产前诊断病例数量、减轻产前诊断的工作量等[16-17]。

高龄孕妇胎儿多较为珍贵，由于介入性产前诊断存在重新穿刺、宫内感染和流产等风险，所以高龄孕妇对介入性产前诊断的依从性并不高。本研究中有487名(46.16%)高龄孕妇共选择先行 NIPT，9例NIPT提示异常，经穿刺后检出6例胎儿染色体有异常，其中1例核型分析结果为47,XXY 的高龄孕妇由于怀孕困难，选择继续妊娠，新生儿生殖器异常。其余568名(53.84%)高龄孕妇选择直接行羊水穿刺，检出12例胎儿染色体有异常。在高龄指征中NIPT 组与羊水穿刺组的检出率间差异无统计学意义(P>0.05)，表明 NIPT 在高龄孕妇中也具有十分良好的表现。

在1 198例的NIPT组中，共有17例 NIPT 提示异常。其中1例提示17号染色体增加高风险，经羊水穿刺确诊为17号染色体三体嵌合体，该孕妇拒绝进一步检查，孕期超声监测未发现异常，后足月分娩，外周血核型正常、未见嵌合体，随访时孩子已经7个月，生长发育未见异常，主要考虑胎盘嵌合体、母体细胞污染、羊水培养细胞分化出畸形克隆和实验误差等原因导致的假性嵌合，所以当产前诊断检测出嵌合体时，应采用染色体微阵列技术(chromosomal microarray analysis，CMA)、荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)和胎儿脐带血核型等方法验证，并结合 B 超等结果，提供科学准确的信息，减少正常胎儿的丢失[18]。本研究发现7例 NIPT 假阳性，NIPT 假阳性的可能原因是胎儿/胎盘嵌合体、双胎之一胎死宫内、母体嵌合体、母源性拷贝数变异、母源性恶性肿瘤，而性染色体由于 X 染色体含有较多的 GC 碱基和失活现象以及与 Y 染色体标记序列的相似性等原因导致检测准确率较低[12,14,16,19]。NIPT 检测也会出现假阴性的现象[16,20]。因此，要科学对待和处理 NIPT 结果，当NIPT提示异常时应当进行产前诊断以避免由于假阳性引起正常胎儿被引产，当 NIPT 阴性时应加强后期B超等监测，避免由于假阴性导致严重的染色体病患儿的出生，从而最大程度地达到优生的目的[21]。

在1 253例的羊穿组中，发现33例染色体异常，其中有9例胎儿染色体异常结果若孕妇选择先行 NIPT 检查可能无法检出，包括1例12-三体嵌合体、1例重复、4例平衡易位、2例罗伯逊易位和1例倒位，因此，临床医生有义务告知孕妇 NIPT 的局限性。遗传咨询后建议12号染色体三体嵌合体的孕妇进一步检查验证是否为假性嵌合体的干扰，但该孕妇拒绝进一步检查，选择终止妊娠。9q21 区段重复的胎儿核型，经追溯与其母亲核型一致，孕期超声监测未发现异常，在充分告知胎儿可能会出现的情况后，该孕妇选择继续妊娠，随访至孩子1岁，生长发育未见异常。染色体异常携带者在减数分裂过程中会产生不平衡配子，可能会有不孕不育、自然流产和染色体异常患儿的出生等风险[22-23]。在充分告知胎儿可能会出现的异常情况后，本研究中的7例染色体异常携带者的孕妇均选择继续妊娠，且新生儿未见异常。

综上所述，血清学筛查风险值异常可以提示除18-三体和21-三体以外的其他染色体异常，而高龄孕妇的年龄越大，胎儿染色体异常发生率越高。本研究表明 NIPT 检测可作为产前诊断技术有效的辅助筛查方法，对于不愿或无法接受产前诊断的血清学筛查风险值异常孕妇和高龄孕妇能够最大限度的降低不行产前诊断的风险。