岗松中抗前列腺素E2受体4拮抗剂筛选及其体内抗类风湿性关节炎作用

蔺小兵，汪 豪，张钧涵，林子豪，严 明*，安晓飞

（1中国药科大学新药筛选中心，南京210009；2中国药科大学天然药物化学教研室，南京210009；3南京中医药大学附属医院内分泌科，南京210029）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种具有高发病率和高致残率的自身免疫性疾病，能够引起软骨基质和骨质破坏［1］。目前RA 临床治疗药物主要包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、抗风湿药（如甲氨蝶呤）、糖皮质激素和生物制剂等，但部分患者对上述药物具有抗药性或药物长期服用具有胃肠道反应等不良反应［2］。同时，RA 治疗药物还包括靶向TNF 和IL-6 的单克隆抗体（mAb）在内的生物制剂可显著改善关节炎和骨破坏。但仍然有大约50%的患者对生物制剂没有反应，并且这些药物可能会增加严重感染的风险［3-4］。

据报道，涉及RA 的多种靶点中，前列腺素E2受体4（EP4）是最有潜力的，和其他阻断前列腺素合成的NSAIDs不一样的是，EP4拮抗剂具有免疫调节和直接抗炎活性［5］。研究发现EP4信号传导促进树突状细胞的IL-23合成及其从周围组织到引流淋巴结的趋化性，是引发T 细胞的关键步骤［6］。重要的是，PGE2-EP4 相互作用促进T 型辅助1 型（Th1）淋巴细胞分化和Th17 增殖。EP4 通常也表达于关节细胞，包括成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞和成纤维细胞样滑膜细胞。EP4信号传导增强破骨细胞的形成和活化，主要参与RA 的骨吸收，且PGE2 加剧了小鼠的胶原性关节炎［5，7］。另外，EP4敲除小鼠可以抵制胶原性关节炎，并且临床、病理学和细胞标志物均下降［8］。临床试验报道EP4 拮抗剂CR6086 是一种潜在的抗类风湿药（https：//clinicaltrials.gov/ct2/show/results/NCT03163966），具有免疫调节和抗类风湿活性［9］。这些说明EP4拮抗剂对RA治疗具有重要意义，故本研究旨在从岗松活性成分中筛选用于RA治疗的EP4拮抗剂。

岗松（Baeckea frutescensL.）属桃金娘科，是一种传统中草药，民间常用于治疗发热、妇女经闭、产后妇女肢体酸痛及类风湿性疾病等。现代研究发现岗松含有丰富的挥发油、黄酮类和间苯三酚类化合物，并且具有广泛的生物学活性，包括抗炎、抑菌、抗病毒和抗肿瘤活性［10］。本课题组之前从岗松醇提取物中分离得到了一系列有效活性成分，主要包括间苯三酚类、黄酮类等，并发现了具有一系列体外具有抗炎活性的化合物，如BF-2（Baeckein E）、Frutescone O 等［6，11-14］。虽然，之前已经筛选了岗松的抗炎化合物，但体内活性和机制研究较少，故本研究从岗松中筛选了EP4 拮抗剂和探讨了体内抗类风湿性关节炎活性，以便发现用于治疗RA的新型EP4拮抗剂。

1 材 料

1.1 药品与试剂

岗松化合物样品均由中国药科大学天然药物化学教研室汪豪教授提供（纯度≥95%）。按照之前文献报道［6，11-14］，从岗松地上部分中提取并分离一系列化合物。简述如下：用95%乙醇回流萃取岗松地上部分（1 kg）2 h，然后减压浓缩提取物。将30 g 残留物重悬于水中，并用石油醚分配，收集石油醚部分。浓缩蒸发收集岗松醇提取物（8.0 g）。最后，硅胶柱色谱柱分离洗脱得到一系列岗松化合 物（BF-ext，BF-2，BF-11，BF-13，BF-18，BF-25，BF-32，BF-19，BF-1，BF-20，BF-12，BF-15，BF-22，BF-48 和BF-45），采用HPLC-UV 鉴定化合物纯度。BF-2 化合物结构式见图1。cAMP-d2 试剂盒（货号：62AM9PEB，法国Cisbio 公司）；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，法国Cisbio 公司）；PGD2（EP4 激动剂）和L-161982（EP4 拮抗剂，上海MCE 公司）；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂（碧云天生物科技有限公司）；阿司匹林、甲氨蝶呤（阿拉丁生化科技股份有限公司）；鸡Ⅱ型胶原（大连美伦生物技术有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMCNa，上海生工生物股份有限公司）。

Figure 1 Structure of BF-2(Baeckein E,C30H34O7)from Baeckea frutescens L.

1.2 仪 器

Envision 多功能酶标仪（美国Perkin Elmer公司）。

1.3 细 胞

HEK293T-EP4 细胞（HEK293T 细胞稳定表达EP4）购自金斯瑞生物科技有限公司（南京）。

1.4 动 物

SPF 级别ICR 小鼠，雄性，体重19～25 g，55 只，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，合格证编号：No.201832838，实验许可证号SCXK（苏）2018-0019。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 细胞培养

HEK293T-EP4细胞用含10%FBS+1%双抗（青霉素和链霉素）+G418（0.5 mg/mL）的DMEM 培养基于37 ℃培养于5% CO2细胞培养箱，待生长至80%～90%，用0.25%EDTA消化细胞传代。

2.2 筛选模型

根据cAMP-d2 试剂盒说明书采用384 微孔板建立筛选模型。

最佳细胞数确定：将HEK293T-EP4 细胞浓度依次用刺激缓冲液（SB溶液）（含1 mmol/L IBMX的DMEM 培养基）将细胞梯度稀释为每毫升2×105、4 × 105和8 × 105个细胞，每孔5 μL，将Forsklin 梯度稀释，第1 个最终反应浓度为100 μmol/L，每孔5 μL，将384 孔板500 r/min 离心15 s，室温孵育45 min，随后加入cAMP-d2和Anti-cAMP混合液（裂解缓冲液稀释）终止反应，室温继续孵育60 min，待孵育结束后，使用多功能酶标仪于665 nm/615 nm处检测信号，计算EC80和信噪比S/B。

激动剂模型：使用上述最佳细胞数及对应的Forsklin EC80进行后续实验，用FSB（含EC80Forsklin 的SB 溶 液）将EP4 激 动 剂PGD2梯 度 稀释，第1 个最终反应浓度为50 μmol/L，每孔5 μL，将细胞稀释至最佳细胞数，每孔5 μL，将384 孔板500 r/min 离心15 s，室温孵育45 min，随后加入cAMP-d2 和Anti-cAMP 混合液（裂解缓冲液稀释）终止反应，室温继续孵育60 min，待孵育结束后，使用多功能酶标仪于665 nm/615 nm 处检测信号，计算EC80。

拮抗剂模型：采用FSB溶液梯度稀释L-161982（EP4拮抗剂），第1个最终反应浓度为100 μmol/L，每孔2.5 μL，与5 μL 细胞混合于室温反应30 min。根据上述激动剂模型实验EC80配制含PGD2的FSB溶液，每孔2.5 μL，加入384 孔板，反应45 min，随后加入cAMP-d2和Anti-cAMP混合液（裂解缓冲液稀释）终止反应，室温继续孵育60 min，待孵育结束后，使用多功能酶标仪于665 nm/615 nm 处检测信号，计算IC50。

2.3 化合物初筛

使用上述建立的EP4 拮抗剂细胞模型从岗松提取物（BF-ext，BF-2，BF-11，BF-13，BF-18，BF-25，BF-32，BF-19，BF-1，BF-20，BF-12，BF-15，BF-22，BF-48 和BF-45）中筛选EP4 拮抗剂，用FSB 溶液稀释化合物（最终反应浓度为100 μg/mL），0.1%DMSO作为阴性对照，L-161982作为阳性对照，每孔2.5 μL，与细胞悬液5 μL 混合于室温反应30 min，加入PGD2继续反应45 min，随后加入cAMP-d2 和Anti-cAMP 混合液（裂解缓冲液稀释）终止反应，室温继续孵育60 min，待孵育结束后，使用多功能酶标仪于665 nm/615 nm 处检测信号，计算化合物抑制率。

2.4 化合物复筛

初筛实验中抑制率达60%以上的化合物进行后续的复筛，将化合物用FSB 溶液梯度稀释8个浓度，第1个最终反应浓度为100 μg/mL，每孔2.5 μL，与5 μL 细胞混合于室温反应30 min，加入PGD2继续反应45 min，随后加入cAMP-d2 和Anti-cAMP混合液（裂解缓冲液稀释）终止反应，室温继续孵育60 min，待孵育结束后，使用多功能酶标仪于665 nm/615 nm处检测信号，计算化合物IC50。

2.5 胶原诱导型类风湿性关节炎模型（CIA）

使用ICR小鼠，尾巴根部皮下注射完全弗氏佐剂（含Ⅱ型胶原，2 mg/mL）免疫诱导类风湿性关节炎模型，对照组仅注射生理盐水，其他各组注射含Ⅱ型胶原的完全弗氏佐剂，体积均为100 μL，分别在第1 次免疫后7 和21 d，注射含Ⅱ型胶原的不完全弗氏佐剂（1∶1）进行二次免疫。选择3 点注射，左后足底、尾根部及背部皮内注射共计100 μL。

2.6 动物分组及给药方法

分对照组、模型组（Model）、甲氨蝶呤（MTX，1 mg/kg）、岗松提取物BF-2（100、50 和25 mg/kg）组，每组5 只。在第1 次免疫后22 d，开始给药，每天1 次，连续给药8 d，对照组及模型组给予等体积的CMC-Na。

2.7 足趾肿胀测量

排水法：首先在每只小鼠的关节处做一标记，其次向内径2 cm 的20 mL 注射器注入纯净水，液面与量筒最高刻度平齐。用最小刻度为0.1 mL的1 mL 注射用针管吸取注射器内的纯净水约1 mL。再把小鼠足跖缓缓伸入注射器内，使标记与注射器最高刻度平齐。再用已吸入水1 mL的针管向注射器内慢慢注入水液，使液面再次与最高刻度及标记平齐。从1 mL注射器上的刻度处读出其内部剩余液体体积，即为小鼠的足趾体积，重复2 次取其均值。

2.8 病理组织学检测

小鼠脱颈椎处死，剔除小鼠踝关节及足趾的皮毛和肌肉，将踝关节及足趾置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后放于10% EDTA 脱钙液（pH 8.0），脱钙15 d，每3 天换一次液，然后用石蜡包埋，切成5 μm 矢状切片，苏木精-伊红（HE）染色，用显微镜观察关节组织的病理形态。

2.9 体内镇痛活性

将ICR 小鼠分为对照组、阿司匹林（200 mg/kg）和岗松提取物BF-2（100、50 和25 mg/kg）组，每组5 只，每天1 次，连续灌胃8 d，最后一次给药后30 min，腹腔注射1.0%冰醋酸0.2 mL，记录15 min内的小鼠扭体次数。

2.10 数据分析

所有数据均采用GraphPad Prism 8.0 软件分析，结果表示为，体外数据用非线性回归分析计算EC50和IC50以及EC80。体内数据用One-Way ANOVA 和Two-Way ANOVA 进行多组数据的检验，Area Under Curve 进行曲线下面积计算，以P ＜0.05为统计学差异。

3 结 果

3.1 EP4拮抗剂筛选模型建立

首先确定了EP4 拮抗剂活性检测的条件，以不同浓度的Forskolin 刺激细胞，结果表明细胞数为每孔4 000 个细胞时，所得信噪比（S/B）最大，且Forskolin EC80为（540.7±63.29）nmol/L（图2-A 和图2-B）；采用上述条件验证了PGD2对EP4 受体的激动活性，其EC50为（8.00±0.53）μmol/L（图2-C）；采用上述条件检测阳性药L-161982 对EP4 的拮抗剂活性，结果表明其IC50为（0.49 ± 0.02）μmol/L（图2-D）。

3.2 EP4拮抗剂活性化合物初筛

初 筛 表 明，BF-2、BF-20、BF-11 和BF-12 对EP4 受体具有较强拮抗活性，其抑制率分别为（102.11 ± 3.45）%、（90.31 ± 3.59）%、（75.72 ±1.79）%和（76.84±1.64）%，见表1。

3.3 EP4拮抗剂活性化合物复筛

复筛表明，BF-2和BF-20对EP4受体的拮抗活性具有量效关系，但BF-2 的拮抗活性较强，其IC50为（0.99±0.08）μg/mL，见图3。

3.4 BF-2对CIA小鼠足趾体积的影响

与对照组小鼠相比，从第7 天开始，模型组小鼠足趾体积显著增加，且一直持续至实验结束，差异有统计学意义（P ＜0.05）；确定造模成功后，从第18 天开始灌胃给药BF-2 和阳性药甲氨蝶呤（MTX），结果表明：与模型组相比，灌胃给予BF-2和MTX 组小鼠的足趾体积显著减小，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图4。

3.5 BF-2对CIA小鼠组织病理学的影响

Figure 2 Establishment of a cell-based 384-well HTRF-cAMP assay for EP4(,n = 3)

Table 1 Inhibition of compounds in preliminary screeningn = 3)

Table 1 Inhibition of compounds in preliminary screeningn = 3)

Compd.BF-ext BF-2 BF-11 BF-13 BF-18 BF-25 BF-32 BF-19 Inhibition/%45.75±1.97 102.11±3.45 75.72±1.79-47.1±1.48-50.37±1.48-62.48±8.15-34.07±2.07-92.59±12.59 Compd.BF-1 BF-20 BF-12 BF-15 BF-22 BF-48 BF-45 L-161982 Inhibition/%21.33±2.89 90.31±3.59 76.84±1.64-68.15±5.93-89.63±5.19-44.44±4.44-30.37±11.11 100.00±4.29

HE 染色结果表明，对照组小鼠关节组织基质均匀分布，关节腔无炎性细胞浸润；模型组小鼠关节组织基质损伤严重，且伴随有部分增生，同时关节腔有大量炎性细胞浸润；BF-2（25 mg/kg）组小鼠关节组织基质损伤稍有缓解，但基质还存在大量坏死，并且关节腔有炎性细胞浸润；BF-2（50 mg/kg）组小鼠关节组织基质排列比较均匀，但存在细胞坏死及炎性细胞浸润；BF-2（100 mg/kg）组小鼠关节组织基质排列均匀，但关节腔有少量炎性细胞浸润；MTX 组小鼠关节组织基质排列均匀，且同时关节腔炎性细胞浸润较少，见图5（红框：软骨基质；黄框：关节腔）。

3.6 BF-2对醋酸引起小鼠扭体次数的影响

对照组小鼠扭体次数为43 ± 4.3 次，BF-2 25 mg/kg 组 小 鼠 扭 体 次 数 为20 ± 5.0 次，BF-2 50 mg/kg 小鼠扭体次数为11 ± 4.6 次，BF-2 100 mg/kg组小鼠扭体次数为8±3.7次，阿司匹林组小鼠扭体次数为32±1.8次，这表明与对照组相比给予化合物BF-2和阿司匹林组小鼠的扭体次数显著下降，差异有统计学意义（P ＜0.05），见图6。

Figure 3 Dose-response curves representing EP4 cAMP responses to compounds which displayed EP4 inhibiting activityn = 3)

Figure 4 Effect of BF-2 on paw volume in CIA micen = 5)

Figure 5 Effect of BF-2 on joint pathology in CIA mice(n=5)

Figure 6 Effect of BF-2 on the number of writhing in acetic acid induced micen = 5）

4 讨 论

在RA 发病机制涉及的多个靶标中，前列腺素E2（PGE2）是最有希望的，因为它与阻碍前列腺素合成的非甾体类抗炎药（NSAIDs）不同，选择性PGE2 受体拮抗剂具有将免疫调节剂和直接的抗炎 活 性 结 合 的 潜 力［15-16］。PGE2 受 体 主 要 包 括EP1、EP2、EP3和EP4。EP4主要表达于巨噬细胞，可作为包括IL-1β 和IL-6 在内促炎细胞因子的放大因子，EP4 拮抗剂可阻断其活性［5，17-18］。另外，EP4信号是RA病理过程中骨吸收相关的主要参与者，因为可以增强破骨细胞的形成和激活［7］。研究表明EP4 敲除小鼠对胶原诱导型关节炎发生与发展具有抗性，且组织病理学和细胞标志物显著下调［8］。因此，本研究首先采用EP4拮抗剂体外活性筛选模型从岗松中筛选了15 个EP4 拮抗剂，其中BF-2活性最强。后续采用体内实验探究了BF-2的抗RA活性。

据报道，CIA 小鼠模型是RA 研究的常见模型之一，其被广泛应用于RA 的各种研究，以探索RA的发病机制和发现RA 的治疗靶点［9，17-21］。赵会勤等［22］研究表明岗松醇提取物能够显著缓解AIA 大鼠的关节炎症状并下调大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 的含量。本课题前期也发现BF-2 能够抑制MALP-2 刺激巨噬细胞IL-1β、IL-6、TNF-α 和一氧化氮（NO）等促炎介质产生［13］。同样，本研究发现灌胃给予CIA 小鼠BF-2 能够显著缓解CIA 小鼠的足趾肿胀和溃烂，且能够缓解醋酸引起的小鼠疼痛，对RA 具有潜在的治疗价值。本研究推测BF-2抗RA 活性可能与抑制炎症介质有关，需在后续实验中进一步探究。滑膜炎和基质破坏在RA 的病理过程中起着关键作用，与RA 的关节肿胀和疼痛密切相关［23］。大量炎性细胞浸润滑膜组织，引起各种促炎细胞因子和趋化因子及金属基质蛋白酶的释放引起软骨基质损伤和破坏，加剧RA 发展［24-25］。本研究采用病理染色发现BF-2 可以缓解CIA 小鼠炎性细胞浸润关节腔及软骨组织，并缓解软骨基质破坏。这些结果均表明BF-2 具有抗RA活性，并且与炎症反应和软骨基质保护有关。

综上所述，本研究从岗松活性成分筛选得到了4 种EP4 拮抗剂，且BF-2 拮抗活性最强。更重要的是，发现BF-2 具有抗RA 活性，且与抑制炎症反应和软骨基质保护有关。但BF-2 抗RA 机制依然不清楚，需后续试验进一步研究。