不同因素对离体培养条件下莲幼胚萌发的影响

王 芸，刘玉平，彭 静，柯卫东

（武汉市农业科学院蔬菜研究所，湖北武汉 430070）

睡莲科（Nymphaeaceae）莲属（Nelumbo Adans）植物是古老的多年生水生草本植物，也是重要的园艺类作物，多以无性繁殖为主。莲属植物包括2 个种，即中国莲（Nelumbo.nucifera Gaertn.）和美洲黄莲（Nelumbo.lutea Pers.）[1]。现在人们所说的莲（Lotus）普遍指的是中国莲。我国是莲的起源中心之一，莲在我国有着悠久的栽培和驯化历史。栽培面积广阔，资源类型丰富，以长江流域和黄河以南地区最适合莲的生长[2]。中国莲和美洲黄莲虽然不存在生殖隔离，但其中有些品种进行杂交后莲胚发生早期败育，导致杂交后代不结实或者结实率低。中国莲种内某些莲品种之间的杂交也存在类似现象。目前，莲育种方法仍以传统的杂交育种为主要方式[3]，不同品种杂交后幼胚发生败育会大大影响莲的育种效率与进程。利用幼胚离体培养对早期杂种胚进行胚拯救的技术已在许多植物中被成功利用，例如小麦[4]、百合[5]、草莓[6]、葡萄[7]、猕猴桃[8]、山核桃[9]等。但现阶段在莲离体培养上，仍以利用莲茎尖为材料进行组织快繁为主，存在易带病、繁殖系数低等缺点[10-11]，对莲胚离体培养的研究非常少，为此开展了莲幼胚在离体条件下的萌发试验，以期为莲幼胚离体培养技术提供理论参考，也可为今后开展莲胚拯救技术研究打下基础。

1 材料与方法

试验于武汉市农科院蔬菜所水生蔬菜花卉研究中心组培实验室中进行，供试材料为武汉市农科院蔬菜所选育的子莲品种“鄂子莲1 号”，选其正常开花授粉后的幼胚为外植体用于离体培养试验。试验所用的诱导培养基均以MS 作为基本培养基，培养基琼脂含量为6.5g/L，pH 值5.8～6.0。

1.1 消毒和灭菌

在田间采下“鄂子莲1 号”正常授粉的花托（尚未膨大成熟的莲蓬）立即带回组培室，在超净工作台上快速取出其内的籽粒，经无菌水清洗3 次，70%乙醇浸泡30s，再用无菌水清洗3 次，然后用0.1%HgCl2消毒90s，最后用无菌水清洗4 次，每次60s。消毒灭菌后，将籽粒置于无菌滤纸上吸干多余水分，用解剖刀剥去籽粒外层嫩种皮，取其内部的幼胚接种于诱导培养基上。

1.2 胚龄对幼胚萌发的影响

分别选取不同胚龄“鄂子莲1 号”的幼胚为材料，包括2d、3d、4d、5d、6d 共5 种胚龄幼胚，经消毒灭菌后接种于含有1.0mg/L NAA、0.5mg/L ZT 和3%蔗糖的诱导培养基上，每种胚龄幼胚各接种50 个，设4 次重复，接种后于24～26℃下暗培养30d 后统计萌发率。

1.3 蔗糖浓度对幼胚萌发的影响

以胚龄4d 幼胚为外植体，经消毒灭菌后分别接种于含有不同蔗糖浓度的诱导培养基（包含1.0mg/L NAA 和0.5mg/L ZT）上，蔗糖浓度分别设为1%、3%、5%、7%、9%，每种培养基各接种50 个幼胚，设4 次重复，接种后于24～26℃下暗培养30d 后统计萌发率。

1.4 不同激素浓度配比对幼胚萌发的影响

以胚龄4d 幼胚为外植体，MS 为基本培养基，加入3%蔗糖，配合不同浓度的NAA 和ZT，共设16 种浓度配比组合（表1），每种培养基各接种50 个幼胚，设4次重复，接种后于24～26℃进行暗培养，30d 后统计萌发率。

2 结果与分析

2.1 不同胚龄对幼胚萌发的影响

选取5 种不同胚龄的莲幼胚接种于含1.0mg/L NAA、0.5mg/L ZT、3.0%蔗糖的MS 培养基上，暗培养30d 后统计幼胚萌发率、褐化率和污染率（表1）。结果表明，3d 和4d 的幼胚萌发率明显高于2d、5d 和6d 的幼胚，以4d 的幼胚萌发率最高（36%），稍高于3d 的幼胚（31%），说明3～4d 的幼胚在离体条件下具有较强的胚性，更适合作为离体培养的外植体材料。

表1 不同胚龄对幼胚萌发的影响

2.2 不同蔗糖浓度对幼胚萌发的影响

将4d 胚龄幼胚分别接种于含有不同蔗糖浓度的MS 培养基上，配合1.0mg/L NAA 和0.5mg/L ZT 激素，蔗糖浓度分别设为1%、3%、5%、7%、9%，暗培养30d后统计幼胚萌发率、褐化率和污染率（表2）。结果显示，培养基蔗糖浓度为3%和5%的幼胚萌发率高于1%、7%和9%的蔗糖浓度，萌发率分别为38%和32%。培养基中的蔗糖浓度过低，不能为幼胚提供足够的碳源，导致萌发率较低；蔗糖浓度过高导致培养基中的渗透压过高，因此阻碍了幼胚的正常萌发，同时过高的蔗糖浓度更易引起污染；当蔗糖浓度适中时，既能为幼胚提供足够的营养，又能保持培养基内渗透压的稳定，从而促进幼胚萌发。因此，培养基中3%～5%的蔗糖浓度更利于离体培养的幼胚萌发。

表2 不同蔗糖浓度对4d 幼胚萌发的影响

2.3 不同激素浓度配比对幼胚萌发的影响

以胚龄4d 幼胚为外植体，MS 为基本培养基，蔗糖浓度为3%，配以不同浓度NAA 和ZT，分别设计4 种浓度的NAA 和ZT 进行试验，共计16 种浓度配比组合，暗培养30d 后统计萌发率、褐化率和污染率（表3）。结果显示，较高浓度NAA 和低浓度ZT 配比的MS培养基有利于幼胚萌发，当NAA 浓度为3mg/L，ZT 浓度为0.5mg/L 时，4d 幼胚萌发率最高，达到71%。相同浓度NAA 条件下，培养基中ZT 浓度越大，萌发率越低。当NAA 浓度为4mg/L 时，萌发率较3mg/L 时均有所降低，说明生长素浓度过高会抑制幼胚萌发。

表3 不同浓度NAA 和ZT 对4d 幼胚萌发的影响

3 讨论

植物幼胚的离体培养是植物胚拯救的技术方法之一，其成败由胚龄、培养基种类、生长调节剂、渗透压和培养条件等多种因素决定[12]。不同植物幼胚离体培养的最佳胚龄各不相同，胚龄对幼胚萌发的影响在不同果树上均有报道[13-15]。除核果类植物外，一般植物幼胚离体培养多采用MS 为基本培养基[12]）。本研究探索了离体培养条件下莲幼胚萌发的不同影响因素。研究表明，胚龄、培养基蔗糖浓度以及培养基激素浓度配比均能影响莲幼胚的萌发生长。在相同诱导培养条件下，2～6d 胚龄中，以4d 胚龄莲幼胚最易萌发；以4d 胚龄幼胚为材料，培养基蔗糖浓度为3%时，幼胚萌发率最高，当培养基蔗糖浓度达到或高于7%时，幼胚早期萌发受到明显抑制，该结论与甜柿幼胚离体培养的研究结果类似[16]；以4d 胚龄幼胚为材料，在含有3.0mg/L NAA 和0.5mg/L ZT 的诱导培养基上，幼胚萌发效果最好，萌发率最高,说明培养基较高浓度的生长素和低浓度的细胞分裂素配比有利于幼胚的萌发，但生长素浓度过高则会抑制幼胚的生长，这也与前人的研究结果相符[12,17]。

目前，莲育种方法仍以杂交育种为主要手段，杂交后代若发生败育则会影响育种进程，利用胚拯救技术可以克服胚败育给育种带来的不良后果，但目前尚未有莲胚拯救技术的相关研究报道。为此，开展了此项研究，旨在为莲幼胚离体培养提供技术支撑，为今后开展莲胚拯救技术研究并应用于莲品种选育等提供参考。