低聚木糖对三倍体虹鳟生长、抗氧化能力及肠道炎症因子基因表达的影响

2021-03-13徐喆王常安刘红柏韩世成陆绍霞冯淇元

大连海洋大学学报 2021年1期

徐喆，王常安，刘红柏，韩世成，陆绍霞，冯淇元，3

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江哈尔滨 150070； 2.南京农业大学无锡渔业学院，江苏南京 210000； 3.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306)

三倍体虹鳟Oncorhynchusmykiss具有不育性、生长速度快、饲料系数低等特点，是中国鲑鳟鱼养殖业中主要的养殖品种。在养殖过程中，由于养殖环境变化、饲料品质不佳等因素，导致鱼体免疫力降低，易感染病原菌，此时，一般可通过施用免疫增强剂等来增强鱼体的抗应激、抗感染能力[1]。

低聚木糖(xylooligosaccharide，XOS)，又名木寡糖，是一种功能性聚合糖，由β-(1, 4)-糖苷键连接的2～7个D-木糖组成，有效成分是木二糖和木三糖，XOS具有优于其他功能性聚合糖的理化性质，如耐高温、耐酸、抗冻性、无配伍禁忌[2]。近年来，在异育银鲫Carassiusauratusgibelio、草鱼Ctenopharyngodonidella、大菱鲆Scophthalmusmaximus和库图拟鲤Rutilusfrisiikutum等试验中发现，XOS对机体的生长性能和免疫防御能力均有不同程度的改善[3-6]，也可提高罗非鱼Oreochromisniloticus的抗氧化功能和先天免疫反应，维持机体健康生长[7]。Chen等[8]研究发现，质量浓度为0.1～100 μg/mL的XOS可抑制TNF-α基因的表达和一氧化氮(NO)的产生，有效降低脂多糖(LPS)诱导的炎症发生。但总的来说，有关XOS对水产动物的营养生理作用还较为有限，其机制尚不明确。本研究中，通过在三倍体虹鳟基础饲料中添加不同水平的XOS，以鱼体生长、血清与肠道抗氧化能力和肠道炎症因子基因为指标评价XOS对机体的影响，旨在为三倍体虹鳟功能性添加剂筛选提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验选用初始体质量为(20.85±0.48)g的三倍体虹鳟幼鱼450尾，购自辽宁本溪艾格莫林虹鳟养殖公司。XOS购自河南鹤壁泰新科技有限公司，纯度为95%。

1.2 方法

1.2.1 试验饲料的制备根据鱼类自身的营养需求，以鱼粉(蒸汽白鱼粉，含粗蛋白质66.2%、粗脂肪5.92%)和大豆粕为蛋白源，鱼油和磷脂为脂肪源，次粉为主要糖源，配制成基础饲料作为对照组，饲料配方见表1，基础饲料中含粗蛋白质40.0%、粗脂肪9.0%。

表1 基础饲料组成(风干基础)

②矿物质元素(每kg饲料)：Fe 25 mg,Cu 3 mg, Mn 15 mg, I 0.6 mg, Mg 0.7 g,Zn 65 mg, Co 0.1 mg, Se 0.1 mg。

Note：①Vitamin premix containing(per kg diet) VC, 100 mg; VE, 60 mg; VK3,5 mg; VA, 15 000 IU; VD3, 3 000 IU; VB1,15 mg; VB2, 30 mg; VB6,15 mg; VB12,0.5 mg; nicotinic acid,175 mg；inositol,1 000 mg；biotin,2.5 mg；and calcium pantothenate,50 mg.

②Mineral premix containing(per kg diet) Fe 25 mg, Cu 3 mg, Mn 15 mg， I 0.6 mg, Mg 0.7 g, Zn 65 mg, Co 0.1 mg, and Se 0.1 mg.

在基础饲料中分别添加不同水平的XOS(0、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%，均为质量分数，下同)，制成5种试验饲料。具体方法如下：将饲料原料过0.18 mm的目筛后用鼓式混合机混匀，再将溶于水后的XOS添加到混合原料中搅拌均匀，用小型制粒机挤压制粒(直径为1.5 mm)，用烘干机干燥，置于-20 ℃下密封保存备用。

1.2.2 试验设计及饲养管理将试验鱼在室内循环水系统中暂养14 d。试验设5组，每组设3个重复，每个重复30尾，投喂含有不同水平XOS的5种试验饲料，每日按照鱼体质量的3%投喂。养殖环境：水源为自来水，水温为12～18 ℃，溶氧>6 mg/L，氨氮<0.1 mg/L，pH为6.5～6.8，饲养时间为56 d。养殖试验结束后饥饿24 h，测定每组鱼的体质量，并计算增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、饲料系数(FCR)等生长指标，计算公式为

WGR=(mt-m0)/m0×100%,

SGR=(lnmt-lnm0)/t×100%,

FCR=mf/(mt-m0)。

其中：mt为终末鱼体质量(g)；m0为初始鱼体质量(g)；mf为饲料摄入量(g)；t为养殖时间(d)。

1.2.3 血清和肠道抗氧化指标的测定从每个试验组随机取9尾鱼(每个重复3尾鱼)，用MS-222(0.5 mL/L)麻醉后，使用1.5 mL注射器从尾静脉采血，4 ℃下静置30 min后，以12 000 r/min离心15 min，取上清液，置于冰箱(-80 ℃)中保存，用于血清抗氧化指标的测定。

将采集血液后的试验鱼于托盘中解剖，采集肠道样品，并剔除肠系膜脂肪和肠道内容物。取肠组织0.5 g加入1 mL PBS在冰浴上用匀浆机搅拌，加PBS至5 mL，取2 mL研磨液以10 000 r/min离心15 min，取上清液，置于冰箱(-80 ℃)中保存，用于肠道抗氧化指标的测定。

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)活性和溶菌酶(LZM)含量的测定均使用建成(南京)生物工程研究所的试剂盒测定。

1.2.4 肠道炎症因子基因表达试验选用鲁氏耶尔森菌Yersiniaruckeri进行免疫刺激，参考本实验室冯淇元等[9]对虹鳟的应用结果，根据预试验得出鲁氏耶尔森菌浓度为8.4×106CFU/mL时，可致鱼患病且特征明显，因此，本试验中通过注射微量病菌诱发虹鳟的炎症反应，进行肠道炎症因子相关基因(IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α和PepT1)表达的测定。

采用“1.2.3节”中的方法采集试验鱼肠道样品，置于冰箱(-80 ℃)中保存。将冻存的肠道组织研磨成粉状，用Trizol法对肠组织中的RNA进行分离、沉淀、洗脱、溶解和保存，使用TaKaRa试剂盒反转录cDNA模板并进行实时荧光定量PCR。

1.2.5 引物设计本试验中所用引物参考虹鳟IL-1β、IL-2、IL-8、TNF-α和PepT1基因的引物序列[10-13](表2)。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，并用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加XOS后虹鳟生长性能的变化

从表3可见：饲料中添加XOS对增重率和特定生长率有一定影响，各试验组增重率和特定生长率随XOS添加量的增加而提高，当添加量为1.00%时达最高值，且显著高于对照组(P<0.05)，其余各组无显著性差异(P>0.05)；饲料系数随XOS添加量的增加略有降低，未达显著性水平(P>0.05)。

表2 Real-time PCR目标基因与内参基因引物序列

表3 饲料中添加XOS对虹鳟生长性能的影响

2.2 饲料中添加XOS后虹鳟血清和肠道抗氧化指标的变化

从表4可见：饲料中XOS的添加量对虹鳟血清SOD、LZM活性和MDA含量具有影响，与对照组相比，0.50%、0.75%、1.00%组SOD、LZM活性显著升高(P<0.05)，1.00%组MDA含量显著降低(P<0.05)；XOS对CAT活性无显著性影响(P>0.05)。

表4 饲料中添加XOS对虹鳟血清抗氧化指标的影响

从表5可见：饲料中添加XOS对肠道SOD、CAT和LZM活性具有一定影响，随XOS添加量的增加，SOD、CAT和LZM活性呈先升高后降低趋势；XOS添加量为0.75%时，SOD、CAT、LZM活性均显著高于对照组(P<0.05)；随XOS添加量的增加，MDA含量有降低趋势，但无显著性差异(P>0.05)。

表5 饲料中添加XOS对虹鳟肠道抗氧化指标的影响

2.3 饲料中添加XOS后虹鳟肠道炎症因子和小肽转运基因表达量的变化

从图1可见：饲料中添加XOS对肠道白介素IL-1β、IL-8基因和肿瘤坏死因子TNF-α基因的表达量均有影响；随XOS添加量的增加，IL-1β、IL-8和TNF-α基因的相对表达量均呈先升高后降低的趋势，分别在0.75%组、0.50%组和0.75%组达最高值，且均与对照组有显著性差异(P<0.05)。

标有不同字母者表示同一基因中不同XOS质量分数组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。The means with different letters in same gene are significant differences in different XOS mass fraction groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.图1 饲料中添加XOS对虹鳟肠道IL-1β、IL-8和TNF-α基因表达量的影响Fig.1 Effects of dietary xylooligosaccharide supplementation on expression of IL-1β,IL-8 and TNF-α genes in rainbow trout

从图2可见：饲料中添加不同水平XOS对虹鳟肠道白细胞介素IL-2和小肽转运载体PepT1基因表达量均有一定影响；IL-2基因表达量在0.25%组达最高值，且显著高于对照组及其他试验组(P<0.05)；PepT1基因表达量在0.75%组达最高值，且显著高于对照组、0.25%组和1.00%组(P<0.05)。

图2 饲料中添加XOS对虹鳟肠道IL-2和PepT1基因表达量的影响Fig.2 Effects of dietary xylooligosaccharide supplementation on expression of intestinal IL-2 and PepT1 genes in rainbow trout

3 讨论

3.1 饲料中添加XOS对虹鳟生长性能的影响

饲料中添加XOS可提高鱼体生长性能。有研究表明，与对照组相比，在异育银鲫饲料中添加质量分数为0.01%的XOS时，可提高其生长性能且消化酶活性最强[14]。本试验结果也表明，XOS可显著提高虹鳟的增重率和特定生长率，但对饲料系数无明显影响。这可能是由于XOS可促进肠道有益菌增殖，并加快肠道蠕动，促进肠道吸收营养物质，从而改善生长性能[15]。

3.2 饲料中添加XOS对虹鳟抗氧化能力和非特异性免疫的影响

3.3 饲料中添加XOS对虹鳟肠道炎症因子和小肽转运基因表达量的影响

白细胞介素参与机体免疫反应的表达和调节，介导T、B细胞活化。IL-1β是由T细胞和巨噬细胞激活后经巨噬细胞产生的一种多效炎症细胞因子，对淋巴细胞的生长和增殖有直接影响，IL-1β通过刺激效应细胞增强免疫应答反应，是特异性免疫和非特异性免疫反应中重要的细胞因子[23]。IL-2为T细胞生长因子，由IL-1β刺激分泌，通过活化T细胞和巨噬细胞的表达促进免疫反应，并有效控制免疫应答[24-25]。IL-8是典型的促炎症因子，在白细胞的趋化性和功能中具有重要作用，对恢复感染组织有一定作用[26]。TNF-α由T细胞和巨噬细胞产生，是参与白细胞迁移、增殖分化及凋亡的重要免疫因子，在炎症反应中刺激免疫细胞并介导免疫应答，具有杀伤或抑制肿瘤细胞的功效[27]。Tafalla等[28]发现，在虹鳟的肝脏、头肾和脾脏中IL-1β均为组成性表达。饲料中添加XOS可显著上调草鱼肾脏、脾脏免疫相关基因IL-1β和TNF-α的表达[29]。本试验结果表明，XOS显著影响虹鳟肠道炎症因子相关基因的表达，对IL-1β、IL-2、IL-8和TNF-α基因有先上调后下调的作用，其中，对IL-1β的影响最为明显。外界刺激能够诱导IL-1β的表达[30]，这表明鱼体在饲喂XOS的免疫初期，炎症因子刺激各种免疫细胞增殖，随着XOS添加量的提高，炎症因子在不同的添加量下达到峰值，这说明XOS能够作用于免疫防御系统，提高免疫因子的表达量，提高机体的特异性和非特异性免疫力，能对病原菌及病毒的抵御起到一定作用，保护机体健康生长[31]。但是，当XOS含量过高时，则抑制了机体的免疫反应，因此，高水平添加剂不利于保持机体内部的动态平衡[32]。

小肽转运载体PepT1主要位于肠道上皮细胞，它是一种完整的膜蛋白载体，主要参与肠道内小肽的跨膜转运，通过转运二肽和三肽为机体运输营养物质，促进动物生长发育，同时也参与炎症反应的免疫应答，在炎症细胞因子通讯中发挥作用[33-34]。本试验发现，PepT1基因随XOS添加水平的提高呈先升高后降低的趋势，并以0.75%组为最高，且与对照组有显著性差异。XOS对于水产动物的作用是通过对肠道有益菌的增殖，进而改善肠道微生态环境，促进机体消化吸收营养物质[35]。本试验饲料中添加低水平的XOS对肠道有益菌的增殖有积极作用，上调了PepT1基因表达量并促进肠道对小肽的吸收，当XOS含量过高时，其发酵产生的酸性物质降低了pH，肠道pH过低后有益菌无法繁殖，菌群结构平衡被打破，肠道吸收力下降，下调了PepT1基因表达量及对营养物质的吸收[36]。