屋尘螨主要过敏原蛋白Der p1的分离纯化

赵慧敏，张丹丹，陈晴，秦凌钰，何韶衡

过敏性疾病是一个全球公共卫生问题，屋尘螨(dust mite)是引起全世界过敏性疾病的主要原因之一。最近研究表明，治愈过敏性疾病的特异性免疫疗法由于不良反应风险限制了其广泛应用，使用纯化或重组过敏原可以提高治疗疗效以及安全性。并且，过敏原组分的单一性是新一代脱敏治疗候选药物的基本要求[1-4]。因此，从复杂的实际屋尘螨样本中分离出单一组分的过敏原蛋白Der p1是进行临床过敏性疾病诊断和治疗的关键。本研究使用PBS-T溶液对屋尘螨干粉中的过敏原蛋白进行粗提取，利用阳离子交换层析对粗提取液中的Der p1进行分离纯化，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对纯化的蛋白质进行鉴定，为临床过敏性疾病的诊断和治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料

屋尘螨干粉样本由锦州市锦州医科大学提供。

1.2 主要仪器与试剂

单盘电子天平(北京赛多利斯仪器有限公司，中国)；Azure C300化学发光成像系统(Azure，美国)；高速冷冻离心机ST16R(Thermo Scientific，德国)；GE AKTA Pure蛋白质层析纯化系统(General Electric Company，美国)；桌上中试型冻干机Lyobeta mini(Telstar，西班牙)；高效液相色谱Waters Alliance HPLC(Waters，Belgium)；Mini-PROTEAN Tetra小型垂直电泳槽(Bio-Rad，美国)；Cascada III I全新智能纯水/超纯水一体化系统(Pall，美国)；甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、丙烯酰胺、N, N-亚甲基二丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250、KH2PO4、NH4HCO3和十二烷基硫酸钠(SDS)(国药集团，上海，中国)；蛋白相对分子质量标准(Takara生物技术有限公司，大连，中国)；磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution，PBS)-0.05 % Tween-20(简称 PBS-T)购自于Takara 生物技术有限公司(大连，中国)。

1.3 屋尘螨粗提液提取

称量屋尘螨干粉0.10 g，加入到20 mL PBS-T溶液中，4 ℃下搅拌过夜，5 000×g离心屋尘螨混悬液20 min取上清液，加入25 mmol/L pH 4.5醋酸钠缓冲溶液20 mL后进行透析，在4 ℃下透析3～4 d。透析完成后，4 ℃保存。

1.4 屋尘螨过敏蛋白Der p1分离纯化

结合液A：pH 4.5 25 mmol/L醋酸钠缓冲液，洗脱液B：1.0 mol/L NaCl溶液。首先用20%乙醇清洗系统泵，然后将阳离子交换层析柱HiTrap Capto MMC连接到AKTA pure仪器上，再用结合液A清洗样品泵，然后用2个柱体积 A平衡柱子。通过样品泵上样，进样体积为1 mL，进样5 min后，用1个柱体积结合液A清洗柱子，然后使用30% B对柱子进行梯度洗脱，冲洗10个柱体积，洗脱完成后，使用A平衡柱子，平衡5个柱体积。

1.5 屋尘螨过敏蛋白Der p1鉴定

采用SDS-PAGE对各组分蛋白进行分析鉴定。12%分离胶和5%浓缩胶对屋尘螨粗提液和经阳离子交换层析分离后蛋白组分进行电泳分析，电泳凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液进行染色，脱色后用凝胶电泳成像系统分析并进行图像采集，与蛋白质标准比对后确定蛋白质的相对分子质量。

2 结果

2.1 屋尘螨粗提液的SDS-PAGE

屋尘螨粗提液中有很多条蛋白区带，其中相对分子质量25 000为主要过敏原蛋白(图1)。

图 1 屋尘螨粗提液主要蛋白质分布Fig 1 SDS-PAGE of major proteins in crude extract of dust mite1：蛋白marker； 2：屋尘螨提取液Mr:相对分子质量

2.2 Der p1的分离纯化

2.2.1 屋尘螨粗提液阳离子交换层析

屋尘螨粗提液的阳离子交换层析结果如图2所示，其中Ⅲ峰为含有目标过敏原蛋白Der p1的收集峰。

图 2 阳离子交换层析色谱结果Fig 2 Result of cation exchange chromatography

2.2.2 SDS-PAGE分析

将图2所示Ⅰ～Ⅴ号5个收集液进行SDS-PAGE分析，结果Lane 3对应的Ⅲ收集液SDS-PAGE可见明显相对分子质量为25 000的蛋白条带(图3)，即目标过敏原蛋白Der p1。

图 3 阳离子交换层析SDS-PAGE结果Fig 3 SDS-PAGE results of cation exchange chromatography0:蛋白Marker; 1～5分别对应Ⅰ～Ⅴ号收集液的蛋白条带Mr:相对分子质量

3 讨论

屋尘螨可导致过敏性哮喘、鼻炎等呼吸系统过敏性疾病，2004年，世界卫生组织估计全球约有3亿哮喘和鼻炎患者，并呈上升趋势[5-7]。

采用蛋白质组学结合药理学手段，可识别出屋尘螨中近几十种过敏原，其中，Der p1 是屋尘螨的主要过敏原之一[8-9]。在室内尘土中Der p1的含量大概为0.02～14.30 μg/g，Der p1的氨基酸个数为320，是相对分子量为25 000的糖蛋白，等电点4.7～7.4。Der p1由两个球状单体组成，两个单体重合面大，是一种紧密的双层蛋白。在Der p1的二级结构中，43.75%为α螺旋结构，作为木瓜蛋白酶家族成员，包含了组氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和镁结合位点等活性位点，在与后期产生过敏反应的过程中起到关键作用[10-12]。目前认为作为气道首要防线的支气管上皮细胞在受到过敏原或病毒等有害因素反复刺激时，可通过分泌一系列细胞因子、趋化因子及黏附分子等炎性介质与自身细胞及其他气道结构细胞、炎性细胞相互作用，参与哮喘的气道慢性炎症过程。有研究表明 Der p1的抗原暴露可直接引起气道上皮损伤及脱落，而由屋屋尘螨抗原导致上皮细胞来源的细胞因子、炎症介质上调，可能是过敏原诱发哮喘或使哮喘加重的原因之一[13]。因此，从复杂的实际屋尘螨样本中分离出单一组分的过敏原蛋白是研究诱发过敏反应发病机制的关键，可实现对屋尘螨过敏患者特异性的诊断与治疗。

本研究旨在对屋尘螨粗提液中的过敏原蛋白Der p1进行分离纯化。首先采用PBS-T溶液作为提取液对屋尘螨中的过敏原蛋白进行粗提取，然后利用阳离子交换层析对屋尘螨粗提液进行初步的分离纯化。结果表明，通过采用PBS-T溶液对屋尘螨中的过敏原蛋白进行粗提取，利用25 mmol/L pH 4.5的醋酸钠缓冲溶液对其进行透析，屋尘螨粗提液中目标过敏原蛋白Der p1含量最高(相对分子质量25 000)，而其他蛋白质含量较少，此操作绿色温和、简单易行，并且蛋白质不易降解。阳离子交换层析结果表明，目标过敏原蛋白Der p1主要分布在Ⅲ峰，SDS-PAGE结果表明，Ⅲ峰中对应的过敏原蛋白与国内外报道的Der p1相对分子质量25 000相一致。分离纯化出来的Der p1具有为重组过敏原、设计低过敏衍生物以及预防性疫苗接种提供依据的潜在价值，还有望开发新一代脱敏治疗候选药物，将为临床屋尘螨过敏性疾病的诊断和治疗奠定基础。本实验研究，利用阳离子交换层析对屋尘螨粗提液进行纯化，成功分离出目标过敏原蛋白Der p1。