安徽省茶树细菌性梢枯病病原鉴定

张雷 汪霞 李相汉 贡长怡 张立新

摘要 ：2017年-2018年在安徽省庐江、东至县茶园种植区发现一种茶树新病害——梢枯病，发病症状表现为顶芽枯死，嫩叶叶柄变褐，叶片枯萎。为明确庐江、东至县茶树梢枯病的病原菌，采用平板划线法和稀释涂布平板法分离病原，按照柯赫氏法则对病原细菌进行致病性测定，并利用细菌的表型特征和分子生物学技术确定病原菌的分类地位。结果表明，从茶树患病叶片和茎干分离到菌落形态一致的细菌菌株共16株，选择6株代表性菌株进行回接试验，确定获得的细菌分离物为该病害的致病菌;通过对测试菌株的生理生化试验、16S rDNA 和16S23S rDNAITS的序列分析，以及基于16S rDNA、16S23S rDNAITS序列的系统发育树分析，将安徽省茶树梢枯病的病原菌鉴定为燕麦嗜酸菌燕麦亚种Acidovorax avenae subsp. avenae。

关键词 ：茶树; 梢枯病; 鉴定; 燕麦嗜酸菌

中图分类号：

S 435.711文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019627

Identification of the pathogen Acidovorax avenae subsp. avenae causing shoot blight of Camellia sinensis

ZHANG Lei， WANG Xia， LI Xianghan， GONG Changyi， ZHANG Lixin*

（College of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China）

Abstract ：A new shoot blight disease of tea plant was found in several tea plantations located in Lujiang and Dongzhi counties of Anhui province from 2017 to 2018. Symptoms initially appeared on the young shoot with watersoaked spots， and then the spots merged into large patches when the disease further developed. Symptoms of young leaf blight could be observed three weeks later. In order to clarify the pathogen associated with the tea shoot blight， the isolates were recovered from diseased samples and determined by using phenotypic characteristics combined with molecular identification. The results showed that 16 bacterial colonies with white color were consistently isolated from symptomatic leaves and stems， and six representative isolates were selected and confirmed to be the causal agent of this disease according to the Kochs postulates. The pathogen was further identified as Acidovorax avenae subsp. avenae based on the physiological and biochemical tests， sequence analysis of 16S rDNA and 16S23S rDNA internally transcribed spacer region， along with phylogenic analysis of 16S rDNA and 16S23S rDNAITS sequences from the tested isolates and reference strains of Acidovorax spp.

Key words ：Camellia sinensis; shoot blight; identification; Acidovorax avenae subsp. avenae

茶樹原产于中国，为多年生常绿木本植物，多分布于亚热带和热带地区。茶树作为一种重要的经济作物被广泛种植，且是世界上最受欢迎的饮料作物[1]。中国是最早开始种植茶树的国家之一，种植的茶树品种类型多样，跨越多个省份。安徽省兼具南北气候特点，其茶园种植区是中国重要的茶区之一[2]。在茶树生长的过程中，茶树的叶和芽会受到许多病害的影响，包括炭疽病、白星病、云纹叶枯病、芽枯病[34]。近年来，随着茶园面积不断扩大、气候环境的改变，一些新的病害逐渐增加并被发现[5]。2017年-2018年，在安徽省茶园种植区（庐江和东至县）发现一种新病害—梢枯病，该病害发生在一年生枝条的嫩梢，病害初期在嫩叶的叶柄部位有褐色坏死斑，随着病害的发展，坏死斑沿叶片基部向上扩展成大的褐色坏死斑块，同时嫩梢表现为顶芽枯死，这严重影响了茶叶的采收。该病害可发生在茶园不同茶树品种上。本文通过病原菌分离、致病性试验以及病原细菌的表型特征和分子鉴定，明确了引起安徽省茶树梢枯病的病原种类，从而为该病害的流行学监测和综合防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害症状观察

2017年-2018年在安徽省庐江和东至县茶园中，采集具有茶树梢枯病典型症状的患病枝条和叶片（‘福鼎大白茶‘安吉白茶‘皖茶91和‘龙井43），观察并记录病害症状。

1.2 病原菌的分离纯化

选取顶梢发病茶树枝条，剪下病健交界处的发病组织，经0.1%升汞2 min，75%乙醇表面消毒30 s，无菌水冲洗3次后，剪碎病组织，加入无菌水制成带菌的病组织悬浮液，静置5～10 min。采用平板划线法和稀释涂布平板法[6]在NA平板上进行细菌分离，将平板置于（28±0.5）℃恒温培养箱中黑暗培养24 h，待细菌菌落长出后，选取细菌单菌落进行纯化，纯化后的菌株保存于试管斜面和30%甘油中备用。

1.3 致病性测定

将代表性菌株在NA培养基上活化48 h，用无菌水配制浓度108cfu/mL的细菌悬浮液，采用注射法接种‘福鼎大白茶品种的健康离体枝条。接种前茶树枝条采用75%乙醇进行表面擦拭消毒，用无菌注射器将细菌悬浮液0.5 mL从供试茶树品种叶柄和茎干交界部位注入，重复3次，无菌水接种‘福鼎大白茶为对照。于（28±0.5）℃、相对湿度大于90%人工气候箱中培养。

1.4 病原菌表型试验

将代表性菌株接种于NA培养基上，（28±0.5）℃恒温培养箱中黑暗培养48 h后，观察菌落形态、质地、大小、透明度及表面光滑程度等培养性状。同时将测试菌株接种于烟草叶片，调查烟草产生过敏性坏死反应情况。菌株部分生理生化性状测试根据Schaad等[7]的方法进行。

1.5 病原菌分子鉴定

用细菌基因组试剂盒提取代表性菌株的基因组DNA。利用16S rDNA引物fD1/rD1、16S23S rDNAITS引物1493f/23r[89]对菌株进行PCR扩增，引物由上海英潍捷基有限公司合成。扩增产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检测，将获得的目的片段送南京擎科生物技术有限公司测序。测序序列提交至NCBI数据库（http：∥www.ncbi.nlm.gov）中进行BLAST同源性序列分析;同时挑选并下载嗜酸菌属Acidovorax内参考菌株的16S rDNA和16S23S rDNAITS序列，分别以睾丸酮丛毛单胞菌Comamonas testosteroni和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌Burkholderia gladioli为外群，用MEGA 7.0的邻接法（NJ）构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 田間病害症状

在茶园茶树的发病枝条上，发病部位主要位于嫩梢，症状表现为顶芽枯死，嫩叶的叶柄变褐坏死，最终嫩梢的叶片凋萎脱落（图1）。

2.2 致病性

本试验选择了6株代表性细菌分离物进行了致病性测定。结果表明，茶树品种‘福鼎大白茶的离体枝条经注射接种10 d后，接种部位明显变褐色（图2a），随后坏死沿叶柄向叶尖部位延伸，同时向嫩梢上部扩展;接种21 d后嫩梢上部茎干变褐，顶部叶片枯萎（图2c），发病症状与田间症状相同。‘福鼎大白茶接种无菌水后，均未观察到发病症状（图2b～c），采用平板划线法对发病的‘福鼎大白茶病组织进行病原细菌的分离，经对重新分离获得菌株的表型和分子鉴定，确定与接种的细菌菌株一致。

2.3 病原菌的表型特征

采用平板划线法和稀释涂布法从茶树发病组织中均分离到菌落形态一致的细菌菌落。细菌分离物在NA培养基上培养48 h，菌落为乳白色、直径0.5～1 mm、表面光滑。革兰氏染色呈阴性，41℃能生长，不水解淀粉，不产生吲哚;能利用吐温80、柠檬酸盐;氧化酶反应、明胶液化等

测定结果为阴性，硝酸盐还原测定结果均为阳性;能利用葡萄糖、蔗糖、甘露醇作为碳源生长;对烟草能产生明显的过敏性枯斑反应（表1）。生理生化性状测定结果与先前鉴定的燕麦嗜酸菌燕麦亚种Acidovorax avenae subsp. avenae[1011]结果趋于一致。

2.4 病原菌分子鉴定

对选择的6株代表性菌株进行16S rDNA片段的 PCR扩增，均得到长度约1 410 bp的目的片段（GenBank登录号MN480566、MN480567、MN480568、MN480563、MN480564、MN480565），测序菌株间的序列相似性为99.9%～100%。BLAST分析结果表明，6株菌株（WCY1、WCY2、WCY3、DLJ1、DLJ2和DLJ3）与A.avenae subsp. avenae G1（MH244342）和FC371（KJ210333）的序列同源性均分别为99.7%和99.8%。通过对测试菌株的16S23S rDNAITS进行PCR扩增和测序，得到目的片段长度约为695 bp的序列（GenBank登录号MN490642、MN649181、MN649182、MN490641、MN649183和MN649184）。BLAST分析结果表明，6株菌株与A.avenae subsp. avenae FC143（DQ360420）的序列同源性为97.2%～97.9%。进一步将本研究的6个测试菌株分别与嗜酸菌属内近缘种参考菌株的16S rDNA和16S23S rDNAITS序列进行聚类分析。结果表明，测试菌株均与A.avenae subsp. avenae的参考菌株紧密地聚在同一分支，其自展支持率均高于70%（图3，4）。结合表型特征试验以及基于16S rDNA和16S23S rDNAITS的聚类分析，确定引起茶树梢枯病的病原菌为A.avenae subsp. avenae。

3 讨论

本文通过对安徽省茶园发生的茶树梢枯病害的病原分离和鉴定，结果表明该病害是由A.avenae subsp. avenae侵染引起，这是该病原菌所致茶树梢枯病在安徽省内首次发现。A.avenae subsp. avenae是一种重要的植物病原菌，其寄主范围广泛，包括玉米、水稻、高粱、燕麦、甘蔗等多种植物[1114]。由该细菌引起的茶树梢枯病目前仅在我国广西茶区发现，且仅限于‘英红4号品种[15]。 2017年在安徽省茶园病害调查发现，茶树梢枯病在多个茶树品种中均有发生，包括‘安吉白茶‘龙井43‘福鼎大白茶‘皖茶91。同时有‘白毫早‘中茶102 等27个茶树品种未见该病害发生。笔者在室内致病性测定中发现，分离获得的病原细菌A.avenae subsp. avenae也可引致‘名山白毫‘舒茶早 品种发病，而对‘浙农117‘铁观音‘鄂茶5号等5个茶树品种未表现出明显的致病性。这暗示了不同茶树品种对病原细菌A.avenae subsp. avenae的抗病性可能存在显著差异。因此，关于茶树梢枯病在我国不同茶区以及不同茶树品种上的发生情况有待于进一步深入调查，从而为明确该病害的发生流行条件及采用抗病育种防治病害策略提供科学的理论依据。

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（責任编辑：田 喆）