利用甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b生产四氢嘧啶的研究

王广交，辛嘉英,，崔添玉，李越，夏春谷

(1.哈尔滨商业大学 食品科学与工程重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150076；2.中国科学院 兰州化学物理研究所 羰基合成与选择氧化国家重点实验室，甘肃 兰州 730000)

四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-吡啶羧酸)是一种普遍存在于嗜盐微生物中的环状亚氨基酸，其可使细胞在极端环境下依然保持活性[1-5]。近年来研究发现，其可被应用于食品[6-7]、医疗[8-14]、美容等[15-19]领域。由于四氢嘧啶具有一个手性碳原子，难以化学合成，故选择生物法合成四氢嘧啶[20-21]。本文探究甲基弯菌MethylosinustrichosporiumOB3b合成四氢嘧啶，该菌存在于泥泞的沼泽或水草茂密的池塘，容易获得，且可以CH4为唯一碳源生长，使用液体无机盐培养基在较低盐浓度下合成四氢嘧啶，经济价值高，环境友好，实用性价值高。目前合成四氢嘧啶的工业菌株有限，以期甲基弯菌MethylosinustrichosporiumOB3b可对四氢嘧啶的生物合成技术提供参考。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

甲基弯菌MethylosinustrichosporiumOB3b由清华大学邢新会教授提供，由本文作者实验室保存，保存条件为4 ℃，保存过程中定期将菌株重复培养;氯化铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硝酸钾、氯化钠、磷酸氢二钠、氯化钙、硫酸镁、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、正丁醇、甲酸、碘、甲醇、乙腈均为分析纯；四氢嘧啶，标准品(≥98%)，润慧生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯。

UV-5100B紫外可见分光光度计；KH-2000双波长薄层色谱扫描仪;RV10旋转蒸发仪；spectrum Two傅里叶变换红外光谱仪；U3000高效液相色谱仪；BLBI0-HYG-FJ2生物反应器摇床；LDZX-50KBS立式高压蒸气灭菌器；SX2-2.5箱式电阻炉；TGL-16高速台式离心机；DL-CG-1ND洁净工作台。

1.2 四氢嘧啶的制备

1.2.1 培养基 无机盐培养基液组成(g/L)：NH4Cl 0.5,K2HPO40.524,KH2PO40.262,KNO31，NaCl 1，Na2HPO40.74,CaCl20.015 1,MgSO40.3,FeCl30.001 67,FeSO40.004,MnSO4·H2O 0.003,ZnSO4·7H2O 0.003 4,NaMoO4·H2O 0.002 4。

1.2.2 甲烷氧化菌的培养 取100 mL培养液于250 mL三角瓶中，将在4 ℃下低温储存的种子液以10%的接种量接种在培养基中，在30 ℃，180 r/min空气浴摇床培养，144 h(6 d)为一个培养周期，期间每隔24 h充一次CH4(CH4与空气体积比为1∶1)。

1.2.3 四氢嘧啶的提取 由于四氢嘧啶在甲醇、乙腈、水中溶解度较高[22]，故选择甲醇、乙腈提取甲烷氧化菌中四氢嘧啶,最终溶解于二次蒸馏水中。取10 mL培养一周期的发酵液在1 800 r/min条件下，离心20 min，分离上清液与菌种。将上清液在140 r/min,40 ℃下旋转蒸发，用甲醇溶解结晶，去除不溶沉淀，将溶液再次旋转蒸发除去甲醇，使用乙腈溶液溶解结晶，过滤除去不溶性杂质，在140 r/min,40 ℃旋转蒸发，除去乙腈溶液，取10 mL二次蒸馏水溶解结晶(粗四氢嘧啶)，转移至10 mL试管中，备用。

1.3 分析方法

为排除实验的偶然性，选用紫外可见光谱仪、薄层色谱、红外光谱多种定性分析方法分析从甲基弯菌OB3b中提取的样品。

1.3.1 紫外-可见光谱定性检测四氢嘧啶 以水溶解四氢嘧啶标准品(95%纯度)，使用UV2450紫外可见光谱仪检测四氢嘧啶标准品在190～230 nm处的紫外吸收，以水溶解提取物在相同检测条件下检测，比较最大吸收峰位置与峰型。

1.3.2 薄层层析定性检测四氢嘧啶 通过薄层色谱辅助紫外-可见光谱实现快速对甲烷氧化菌OB3b中提取的四氢嘧啶定性分析。使用GF254型硅胶板，以正丁醇-甲酸-水混合液(V/V/V,6∶2∶2)为展层剂，以碘为显色剂，使用KH-2000型薄层色谱扫描仪观测样品与标准品进行比较。

1.3.3 红外光谱定性检测四氢嘧啶 由于紫外-可见光谱与薄层色谱检测都存在一定的偶然性，为确保实验准确性,做进一步红外光谱检测。取0.25 g KBr研磨均匀，使用压片机压片，将压片置于红外光谱仪光路中进行背景扫描，扣除KBr与空气背景。分别将一定量的标准品、样品与0.25 g KBr混合均匀，研磨，压片，扫描，将样品的红外光谱图与标准品的红外光谱进行比较。

1.3.4 四氢嘧啶的定量检测方法 选用高效液相色谱法，使用 Eclipse XDBC18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，在柱温为27.5 ℃柱压力为35.3 MPa条件下定量检测四氢嘧啶。以乙氰/甲醇(体积比为95∶5)混合溶液为流动相，流速为1 mL/min的条件下运行10 min。标准四氢嘧啶以二次蒸馏水为溶剂,配成0.5 g/L的溶液，使用0.23 μm的水系膜过滤，样品经过同样的处理，在以上检测条件下进行检测。根据标准品的浓度、峰面积及样品的峰面积计算样品的浓度。

2 结果与讨论

2.1 紫外-可见光谱检测结果

紫外-可见光谱检测结果见图1。

图1 四氢嘧啶紫外-可见光谱检测结果图Fig.1 UV-visible spectrum of ectoine

由图1可知，标准品在205 nm波长下有最大吸收峰，甲烷氧化菌中提取四氢嘧啶最大吸收峰位置在200～205 nm，峰型与标准品几乎相同。

根据以上检测结果，在205 nm下测定样品可实现对样品的初步快速定性检测，并可以根据标准品在205 nm下的标准曲线对样品快速做出初步的定量分析。标准曲线R2值为0.999 8，方程为y=4.292 8x+0.082 4(x为检测样浓度，y为检测样在205 nm处吸光值)。

2.2 薄层层析检测结果

薄层层析检测结果见图2。

图2 TLC定性检测甲烷氧化菌O3Bb中四氢嘧啶含量Fig.2 TLC of ectoine from Methylosinus trichosporium OB3b

由图2可知，四氢嘧啶在硅胶板上出现明显的点，与标准品相比较，其Rf值基本一致,点2有一部分物质随展层剂扩散到与标准品相似高度，一部分物质未随展层剂扩散，推测该成分中可能含有羟基四氢嘧啶。由于四氢嘧啶是羟基四氢嘧啶的前体，且他们结构及性质极其相似，所以他们经常同时存在并且难以分离，其他菌株合成四氢嘧啶的研究中也存在这一问题。该方法可能可将四氢嘧啶与羟基四氢嘧啶分离开，提高四氢嘧啶纯度。

2.3 红外色谱检测结果

四氢嘧啶的红外光谱见图3。

图3 四氢嘧啶红外图谱Fig.3 IR spectrometry of ectoine

由图3可知，四氢嘧啶标准品与四氢嘧啶提取样品的红外图谱特征明显。由于提取样品纯度相对标准品较低，其中含有其他杂质，故样品的红外光谱发生蓝移。

根据以上定性检测结果，可以初步判定甲基弯菌MethylosinustrichosporiumOB3b在最适盐浓度下可以合成四氢嘧啶。

2.4 高效液相色谱检测结果

在最适盐浓度下培养甲烷氧化菌，使用有机溶剂提取培养一周期(6 d)后菌种内外的四氢嘧啶，为得到均一稳定的高效液相色谱图，将样品稀释8～64倍，在紫外检测器中检测到明显吸收峰后，在高效液相色谱中进样，将检测结果样品图与标准品的高效液相色谱图进行比较，结果见图4。

图4 四氢嘧啶高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of ectoine

由图4可知，提取样品出峰时间在1.373～1.390 min，峰型与出峰时间均与标准品相似，说明甲烷氧化菌中含有四氢嘧啶，并可使用该方法定量分析。

2.5 合成四氢嘧啶产量

由检测得到的标准品与样品的峰面积，用式(1)和(2)计算,细胞内外四氢嘧啶产量和为(84.9±5.49) mg/(g·d)，最大产量为139.75 mg/(g·d)，低于工业生长菌株[工业用菌最大产量为150.5 mg/(g·d)][21]，但略高于使用Methylomicrobiumalcaliphilum20Z合成四氢嘧啶的产量(70.4±14.3) mg/(g·d)。 用式(3)计算释放率(释放到细胞外的四氢嘧啶所占总四氢嘧啶的百分含量),为83.09%～96.63%。

(1)

(2)

(3)

式中A1——标准四氢嘧啶峰面积；

A2——提取四氢嘧啶峰面积；

C1——标准四氢嘧啶浓度，mg/mL；

C2——提取四氢嘧啶浓度，mg/mL；

m1——细胞干重，g；

V——溶液的体积，mL；

T——培养时间，d；

Q——四氢嘧啶产量，mg/(L·d)；

m外——细胞外四氢嘧啶质量，mg；

m——细胞内外四氢嘧啶总质量,mg；

W——四氢嘧啶释放率，%。

3 结论

甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumOB3b可以合成并分泌四氢嘧啶，在较低盐浓度条件下同样可以合成四氢嘧啶，这可以解决细胞在高盐浓度下难以积累以及高盐浓度对设备的损害两大目前工业生产所面对的难题。虽然该菌株合成四氢嘧啶的产量低于工业生长菌株[工业用菌最大产量为150.5 mg/(g·d)]，但其产量略高于使用Methylomicrobiumalcaliphilum20Z合成四氢嘧啶的产量(70.4±14.3) mg/(g·d)，并且在后续研究中培养条件的优化可以使四氢嘧啶的产量得到提高。

与工业菌株长盐单胞菌(Halomonaselongate)相比，甲烷氧化菌可以甲烷为唯一碳源生长，经济价值高于以糖为碳源生长的工业菌株，使用液体无机盐培养基，提取纯化工艺相比固体培养基培养的菌较简单，但甲基弯菌OB3b相比其他菌生长速度低，待进一步研究，以期工业使用。