东方百合‘索邦’的离体培养研究

贾明良, 方荷芳, 李同建, 文锋, 韩兴杰, 金洪光,徐玲玲, 廖亮

(九江学院药学与生命科学学院, 江西 九江 332000)

百合为百合科百合属的多年生观赏植物，其品种丰富，花色多样，具有非常高的观赏价值。东方百合‘索邦’为百合切花市场的知名品种。我国市场的百合鲜切花种源主要有进口和国产两个来源，但国产种球的切花品质要低于进口种球，究其原因，种球质量是其中的重要因素[1]。虽有研究表明，可以通过高山繁育技术来解决种球品质退化的问题[2]，但由于传统的百合生产无论是自然繁殖还是鳞茎片扦插繁殖[3]，在繁殖过程中都会由于病毒的侵染和积累导致种球品质下降。如何大量得到种球的同时提高种球品质，是提高国产种球质量，满足市场需求的必经之路。

针对病毒的侵染，已有学者进行了茎尖和超低温脱毒研究[4]。利用组织培养技术对东方百合‘索邦’研究获得优质种苗，也有一些报导[5-6]，所用到的外植体类型有鳞茎[7-8]、花器官[9-10]、叶片[11-12]等，也有学者进行了射线辐射[13]和转基因[14]等研究。由于东方百合‘索邦’的市场需求量较大，其离体培养技术还有待进一步完善，以期为规模化种苗的生产提供理论和技术基础。本研究利用市售的东方百合‘索邦’鲜切花为材料，取其花器官为外植体，培养得到无菌苗，而后比较组培苗不同部位的愈伤组织诱导率，进一步进行愈伤组织诱导、丛生芽增殖和生根培养等方面研究，为完善东方百合‘索邦’的离体培养体系，进行优质种球的规模化生产提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料东方百合‘索邦’鲜切花购自花店，以含苞待放的花朵为佳，购买后将材料置于采样袋内，喷水保湿后带回试验室。

1.2 试验方法

1.2.1初始诱导外植体的选取 以子房、花梗及花瓣作为外植体，流水冲洗后，75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗3次，然后升汞灭菌5 min，无菌水冲洗6次。将子房、花梗和花瓣切成小块，大小0.5 cm左右，接种到 MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂，pH 5.8的培养基中。培养条件为：光照强度1 500～2 000 lx、光照时间12 h·d-1、温度(25±1)℃。25 d后统计污染率、存活率及愈伤诱导率。

1.2.2愈伤诱导外植体比较 将初始诱导的愈伤组织继续培养成苗，培养60 d后，小苗株高为3～5 cm时，取叶片和鳞茎片，将材料分为叶片上部、叶片中部、叶片下部和鳞茎片 4个部分后，接种于 MS+1.0 mg·L-12,4-D +0.5 mg·L-16-BA +30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂，pH 5.8的培养基中培养，培养条件同1.2.1。培养45 d后观察统计不同外植体类型的愈伤诱导率、死亡率、丛生芽诱导率等。

1.2.3愈伤诱导培养基筛选 以1.2.2试验中得到的愈伤诱导较好的叶片下部和鳞茎片为外植体，设置5种愈伤诱导培养基，分别为MS+0.2 mg·L-12,4-D(YS1)、MS+ 2.0 mg·L-12,4-D(YS2)、MS+ 0.2 mg·L-16-BA(YS3)、MS+2.0 mg·L-16-BA (YS4)、MS+2.0 mg·L-12,4-D +0.2 mg·L-16-BA (YS5)。接种后培养，培养条件同1.2.1。培养45 d后观察统计愈伤诱导率、丛生芽诱导率、生根率等。

1.2.4丛生芽诱导培养基筛选试验 为方便统计丛生芽诱导的增殖倍数，将诱导得到的不定芽切去叶片，进一步再切成黄豆大小接种到添加不同浓度6-BA、NAA配比的MS培养基中进行丛生芽诱导，包括MS+l.0 mg·L-16-BA +0.l mg·L-1NAA(CSY1)、MS+l.0 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA(CSY2)、MS+2.0 mg·L-16-BA +0.l mg·L-1NAA(CSY3)、MS+2.0 mg·L-16-BA + 0.5 mg·L-1NAA(CSY4)、MS+5.0 mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1NAA(CSY5)。培养条件同1.2.1。培养45 d后观察统计分化率、增殖倍数、丛生芽生长情况等。

1.2.5生根诱导培养基筛选试验 将生长一致且健壮的无菌苗单株切下，如有长根切去根，接种到含有不同浓度NAA的MS培养基中，NAA设定浓度为0.1 mg·L-1(SG1)、0.2 mg·L-1(SG2)、0.5 mg·L-1(SG3)、2.0 mg·L-1(SG4)及5.0 mg·L-1(SG5)。每天观察直至出根，记录出根天数。培养条件同1.2.1。培养45 d后观察统计生根率、出根天数、根数、根长、生根苗状态等。

1.3 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 18.0软件对试验数据进行统计、分析和绘图。

2 结果与分析

2.1 初始诱导外植体选择

不同花器官部位的愈伤组织诱导结果见表1，可见，相同灭菌条件下，子房外植体的污染率为5.33%，显著低于花梗和花瓣。存活率方面，子房外植体最高，花梗次之，花瓣最低，不同部位之间差异显著。究其原因可能是花梗，尤其是花瓣暴露在外，污染率较高，加上褐化的产生，导致存活率较低。从愈伤诱导率方面看，子房外植体最高，为84.33%，显著高于花梗和花瓣，花瓣的愈伤诱导率最低，仅为5%，可能跟花器官的发育程度以及幼嫩程度有关。因此综合考虑，初始诱导建立无菌体系应选择子房作为外植体。

表1 不同花部位初始诱导效果比较Table 1 Comparison of initial induction effect of different parts of flower (%)

2.2 愈伤诱导外植体比较

对无菌苗的不同部位进行愈伤诱导，结果(表2)可见，各部分的愈伤诱导率最高的是叶片下部，为100%；其次是鳞茎片，为93.1%；叶片上部最低，愈伤诱导率仅为6.57%。叶片上部虽有分化能力，但愈伤诱导率极低，死亡率最高，达54.43%；叶片中部愈伤诱导的死亡率也较高，为13.43%；而叶片下部和鳞茎片的死亡率均为0。由于百合愈伤生长和丛生芽生长并无明显界限，因此也统计了丛生芽诱导的情况。不同部位均可诱导产生丛生芽，以叶片下部为外植体的丛生芽诱导率最高，为93.10%，显著高于其他3种外植体；其次为鳞茎片，丛生芽诱导率为79.67%。

表2 不同外植体的愈伤诱导能力Table 2 Callus induction ability of different explants (%)

无菌苗不同部位诱导的生长情况(图1)显示，叶片下部和鳞茎片得到的愈伤组织及丛生芽呈现黄绿色，生长健壮，而叶片上部和叶片中部诱导的愈伤组织部分发生褐化、死亡，且愈伤组织及丛生芽长势较弱。综合愈伤诱导统计情况及诱导材料生长状况，进行愈伤诱导时适宜选用叶片下部或鳞茎片作为外植体。

2.3 愈伤诱导培养基筛选

不同愈伤培养基的外植体生长情况(表3)可知，培养基YS2和YS5的叶片下部愈伤诱导率显著高于其他3个培养基处理；培养基YS2鳞茎片的愈伤诱导率最高，显著高于其他4个培养基处理，其次为YS5。培养基YS2叶片下部的丛生芽诱导率最高，为99.33%，显著高于其他4个培养基处理，其次为YS5；而培养基YS4和YS5的鳞茎片的丛生芽诱导率显著高于其他3个培养基处理，丛生芽诱导率分别为80.00%和79.00%。综合愈伤诱导率和丛生芽诱导率，叶片下部和鳞茎片的合适愈伤诱导培养基为YS2和YS5。此外，在诱导过程中发现，YS1和YS2培养基中，产生丛生芽的同时还会生根，叶片下部的生根率分别为86.23%和93.43%，鳞茎片的生根率分别为93.43%和100%，而根的存在会影响后续的切割接种。因此，YS5为最合适的愈伤诱导培养基，即MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂，pH 5.8。

表3 外植体在不同激素组合培养基的生长情况Table 3 Growth of explants in medium with different hormone combinations (%)

2.4 丛生芽增殖培养基筛选结果

不同培养基的丛生芽增殖情况见表4，可见，不同培养基的分化率均为100%，但增殖倍数有所差异，CSY5的增值倍数最高，为3.96倍，其次为CSY3(3.44)和CSY1(3.26)，三者间差异显著，增殖倍数最低的为CSY4和CSY2，分别为 3.18和3.14倍，两者无显著差异。从丛生芽生长情况看，CSY5处理虽然能诱导得到较多的丛生芽，但芽的叶片卷曲且有部分玻璃化现象产生。而CSY3处理的丛生芽较为瘦弱，并有一半生根。CSY4除增值倍数较低外，芽较小，叶片出现卷曲玻璃化现象。CSY2的芽弱小、有一半已生根，且增殖倍数较低。综合考虑，选择CSY1(MS+l.0 mg·L-16-BA +0.l mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖 +6.5 g·L-1琼脂)作为最佳丛生芽诱导培养基，得到的增殖倍数虽不是最高，但其得到的丛生芽比较整齐，叶片宽大，且无根，利于后续增殖切割或进一步进行生根培养操作。

表4 不同激素配比对丛生芽增殖的影响Table 4 Effects of different hormone combinations on proliferation of cluster buds

2.5 生根诱导培养基筛选结果

对不定芽进行生根诱导培养，结果见表5，可见，不同NAA激素水平下，生根率均为100%，出根天数也无差别，均为7 d。根长度方面虽有差别，但无显著差异。从根数量来看，最多的为SG5培养基，根数量达13.77；其次为SG3，根数量为12.53；SG4、SG2和SG1的根数量分别为11.57、10.37和8.5，不同培养基之间均存在显著差异。从根和植株生长状态(表5，图2)来看，生根数量最多的SG5培养基，苗的根粗长，有大量根毛，会粘附培养基，不利于清洗移栽，且植株叶片稀疏(图2F)。而SG3的根数量虽不是最多，但较粗壮，且植株叶片较多，利于后续移栽(图2D)。SG4不仅根数较SG5和SG3少，且根短粗，叶细长稀疏。而SG2和SG1不仅根数少，且根细长，根毛少。因此，选择SG3(MS+0.5 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖 +6.5 g·L-1琼脂，pH 5.8)作为生根培养基。

表5 不同激素配比对生根的影响Table 5 Effects of different hormone combinations on rooting

3 讨论

目前，对于东方百合‘索邦’的组织培养，多数采用鳞茎片作为外植体[7-8]，鳞茎片作为外植体具有诱导效率高的特点，但由于其生长于地下，因此灭菌有一定难度。也有利用株芽、茎段和叶片等为外植体的报导[15-16]。花器官作为外植体具有品种特征突出，取材方便，灭菌容易等特点，主要取材部位为花瓣、花丝、花托和花梗[9-10]。本研究预试验发现花丝作为外植体发生全部褐化。因此，主要选用花梗、子房和花瓣为外植体。研究发现，应选择子房作为初始诱导的外植体，与潘娟[17]的研究结果一致。

将初始诱导得到的丛生芽进行愈伤诱导增殖时需要进行材料的选择，本研究本着充分利用材料的出发点，将丛生芽分为叶片上部、叶片中部、叶片下部和鳞茎片4个部分进行诱导，发现叶片下部的诱导率最高，其次是鳞茎片，叶片中部和叶片上部较低。这是因为百合的诱导效果具有位置效应，总体来说，诱导效果从下到上依次降低[18]，但本研究发现叶片下部诱导效果优于鳞茎片，可能是跟品种不同有关。最佳的愈伤诱导培养基为MS+2.0 mg·L-12,4-D +0.2 mg·L-16-BA +30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂，pH 5.8，其中2,4-D的浓度达2.0 mg·L-1，可见高浓度的生长素有利于愈伤组织的产生。在诱导愈伤时发现，愈伤产生后基本都会产生不定芽，表明百合不定芽的发育与愈伤组织生成之间并无显著的阶段分隔，有学者完成了百合外植体直接诱导成苗的研究[19]，可见百合的不定芽诱导是较为容易的。本研究在诱导不定芽时依然发现叶片下部显著优于鳞茎片，但在进行百合种苗工厂化扩繁时，还是建议将各类外植体充分综合利用。

在进行丛生芽诱导培养基优化时，本研究发现较高的“分裂素/生长素”比值处理CSY5(MS+5.0 mg·L-16-BA +0.2 mg·L-1NAA )得到的增殖倍数要显著高于较低“分裂素/生长素”比值处理CSY1(MS+1.0 mg·L-16-BA +0.1 mg·L-1NAA)。但CSY1得到的丛生芽比较整齐，叶片宽大，且无根，利于后续增殖切割操作或进一步进行生根培养操作，这与夏九成等[20]和钱琼秋等[21]研究一致。

东方百合‘索邦’的生根诱导相对比较容易，在愈伤诱导以及丛生芽诱导过程中由于添加生长素，加之其内源激素的影响均发现有根长出，这与现有[21-23]研究一致，即IAA、IBA、NAA以及与BA、活性炭等的配合等均能够诱导生根。本研究利用单一NAA作为生根诱导激素，不同浓度下生根均达到100%，但植株生长受到一定影响。综合考虑生根及植株的生长状态，选用SG3(MS+0.5 mg·L-1NAA +30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1琼脂，pH 5.8)作为生根培养基。炼苗移栽也是百合种苗生产的重要步骤，后续可进一步深入研究，为百合种苗生产提供基础。