Pb、Zn复合作用对烤烟抗氧化酶及碳氮代谢的影响

保志娟, 金蓉, 杨金清, 张琦, 朱永立, 赵正雄

(云南农业大学烟草学院， 昆明 650201)

近年来，随着工业化的发展及长时间矿产资源的开发利用，土壤中重金属含量剧增，导致农产品重金属超标等安全性问题层出不穷[1]。镉(Cd)、铅(Pb)、汞 (Hg)、铬(Cr)、砷(As)和镍(Ni)等有害重金属难以被微生物降解，进入土壤后易积累进而转化为毒性更大的甲基化合物。由于高等植物在整个生命周期中是固着生长的，其被动性地在体内累积重金属，当积累到一定数量时，就会影响植物的生长发育[2]。

烟草作为我国主要的经济作物之一，易积累重金属。重金属含量过高的烟草植株不仅生长发育和产量会受到较大影响, 烟叶品质也会明显降低[3-5]。同时，许多研究表明，含有重金属的卷烟在抽吸过程中会通过主流烟气进入人体，对人体健康造成危害[6-7]。因此，减少烟草重金属含量已成为国内外研究的热点。张艳玲等[8]研究表明，我国烟叶中的重金属元素以Pb和Cd为主。土壤中Pb浓度的增加能引起烟草根、茎和叶中Pb含量增加，且以根中Pb含量增幅最大[9]。高浓度Pb会影响烟草种子的发芽势和发芽率，抑制叶片的抗氧化酶活性，改变叶肉细胞的亚显微结构[10]。

不同元素和重金属作用，尤其是有益元素和金属元素的联合作用，可能会加强或减缓重金属对烟草的毒性。锌(Zn)是植物生长、发育必需的微量元素。据报道，Zn能缓解重金属Cd的毒性效应[11-12]。另外，Pb2+在生物体内常常与Zn2+和Ca2+的结合位点作用[13]。谭光群等[14]研究也表明，少量Zn加入有助于Pb从烟株根部向地上部转移，这对于受重金属污染的植物自身修复非常有意义。目前，关于烟草重金属胁迫的研究大多只关注单一重金属对烟草的毒性作用及机理，而重金属复合污染对烟草的胁迫机制研究却鲜有报道。本文采用土培方法，研究了不同浓度重金属Pb、Zn复合作用(Pb×Zn)对烟草抗氧化酶和碳氮代谢的影响，以期为重金属污染下烟草的耐性机制研究及缓解Pb污染提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试烤烟品种为红花大金元，种子来源于玉溪中烟种子有限责任公司。试验土壤取自云南农业大学农业实验基地，土壤类型为壤土，pH为6.97，含水率18.78%，土壤有机质含量7.06 g·kg-1，有机碳4.10 g·kg-1，硝态氮2.33 mg·kg-1，铵态氮4.89 mg·kg-1，速效磷11.69 mg·kg-1，速效钾77.18 mg·kg-1。试验土壤铅含量为27.1 mg·kg-1，锌含量为117 mg·kg-1，皆低于GB 15618—2018《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》[15]中规定的土壤污染风险筛选值(铅120 mg·kg-1，锌250 mg·kg-1)。

1.2 试验设计

试验在云南农业大学烟草科学与工程中心进行。采用2因素4水平完全试验设计，Zn浓度设置为：0、20、60、100 mg·kg-1，Pb浓度为：0、150、450、750 mg·kg-1，共16个处理(不施重金属的处理为对照)。采用盆栽试验，每个处理设3次重复，每个重复3盆。将通过漂浮育苗，长势一致的烟苗在苗龄为55 d时移栽入花盆，每盆装风干土10 kg，施用烟草专用复合肥40 g作基肥(N∶P2O5∶K2O=15∶5∶25)。Zn和Pb分别用Zn2SO4和Pb(OAc)2配制成不同浓度水溶液，于移栽后15 d以模拟污灌方式一次性施入，后期正常管理。

1.3 测定指标及方法

在烟苗移栽后30和50 d时，用打孔器取7～11叶位的一定质量烟叶，测定其各项指标。其中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用硝基四氮唑蓝光还原法测定[16]，过氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈创木酚法测定[16]，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[16]，脯氨酸(proline，Pro)含量测定参照磺基水杨酸法[17]，硝酸还原酶(nitrate reductase，NR)活性参照邹琦[18]的方法测定，蛋白质含量采用考马斯亮蓝G-520法测定[17]，蔗糖酶采用李合生[19]的方法测定，可溶性糖含量采用蒽酮法进行测定[20]。

1.4 数据处理

采用Excel 2013、SPSS 19.0和Origin 2017软件对试验数据进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 Pb、Zn复合作用对烟叶MDA和脯氨酸含量的影响

由图1可知，在Pb、Zn单独处理时，烟叶的MDA和脯氨酸含量均随Pb或Zn浓度的增加而增加。中低浓度(150及450 mg·kg-1)Pb复合Zn处理，烟叶MDA和脯氨酸含量随Zn浓度增加而增加，750 mg·kg-1Pb复合Zn处理则呈现先增后减趋势。750 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn复合处理时，烟叶的MDA含量最高，分别比对照增加45.9%(移栽后30 d)和51.9%(移栽后50 d)。移栽后50 d，750 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn复合处理时，烟叶脯氨酸比对照增加580.1%。

图1 Pb、Zn复合作用对烟叶MDA和脯氨酸含量的影响Fig.1 Combination effect of Pb and Zn on MDA and proline content in tobacco leaf

2.2 Pb、Zn复合作用对烟叶SOD和POD活性的影响

由图2可知，Pb、Zn单独处理及中低浓度(150及450 mg·kg-1)Pb复合Zn处理下，叶片SOD和POD活性均随Pb或Zn浓度的增加呈现先增后减的趋势。450 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn复合处理时，烟叶SOD和POD活性较高，移栽后30 d时分别比对照增加22.9%和64.7%。高浓度(750 mg·kg-1)Pb复合Zn处理下，移栽后30 d时，烟叶SOD活性随Zn浓度增加呈现增加-降低-增加的趋势；移栽后50 d时，SOD活性随Zn浓度增加呈现先降低后增加的趋势。而POD则与之相反。移栽后50 d时，450 mg·kg-1Pb及20 mg·kg-1Zn复合处理下，烟叶SOD活性最高，比对照增加19%；750 mg·kg-1Pb及100 mg·kg-1Zn复合处理下，烟叶POD活性最高，比对照增加了71.4%。

2.3 Pb、Zn复合作用对烟叶NR活性的影响

由图3可知，在Pb、Zn单独处理时，烟叶NR活性均随Pb或Zn浓度的增加呈现先增后减的趋势。450 mg·kg-1Pb单一作用下，烟叶NR活性较高，移栽后30和50 d时，分别比对照增加24.7%和18.9%；60 mg·kg-1Zn单一作用下，烟叶NR活性较高，移栽后30和50 d时，分别比对照增加19.8%和53.9%。随着Zn浓度增加，中低浓度(150及450 mg·kg-1)Pb复合Zn处理下，烟叶NR活性表现为先增后减，而750 mg·kg-1Pb复合Zn处理则呈增加-降低-增加的趋势。2个生长时期，450 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn复合处理下，烟叶NR活性最高，分别比对照增加119.3%(移栽后30 d)和102.1%(移栽后50 d)。

图2 Pb、Zn复合作用对烟叶SOD和POD活性的影响Fig.2 Combination effect of Pb and Zn on SOD and POD activity in tobacco leaf

图3 Pb、Zn复合作用对烟叶NR活性的影响Fig.3 Combination effect of Pb and Zn on NR activity in tobacco leaf

2.4 Pb、Zn复合作用对烟叶蛋白质含量的影响

由图4可知，单一Pb处理下，移栽后30 d时，烟叶蛋白质含量随Pb浓度增加呈先增后降趋势;而移栽后50 d时，烟叶蛋白质含量则随Pb浓度增加而增加。单一Zn浓度为60 mg·kg-1时，烟叶蛋白质含量最高，分别比对照增加10.4%(移栽后30 d)、43.4%(移栽后50 d)。中低浓度Pb复合Zn处理下，烟叶蛋白质含量随Zn浓度增加，呈现先增后减的变化趋势；高浓度Pb复合Zn处理下，烟叶蛋白质含量随Zn浓度增加呈现增加-降低-增加趋势。

2.5 Pb、Zn复合作用对烟叶蔗糖酶活性和可溶性糖含量的影响

由图5可知，在Pb、Zn单独处理时，烟叶蔗糖酶活性及可溶性糖含量随金属离子浓度的增加呈现低促高抑的变化趋势。复合作用下，随Zn浓度增加，中低浓度Pb处理烟叶的蔗糖酶活性大体呈先增后降变化，高浓度Pb处理的蔗糖酶活性呈增加趋势。移栽后30 d时，150和750 mg·kg-1Pb处理的烟叶可溶性糖含量随Zn浓度增加呈增加-减少-增加的变化；450 mg·kg-1Pb处理烟叶的可溶性糖含量随Zn浓度增加呈先增后降的变化。移栽后50 d时，各浓度Pb处理的烟叶可溶性糖含量均随Zn浓度增加而增加。移栽后30 d时，烟叶可溶性糖最高值在450 mg·kg-1Pb及60 mg·kg-1Zn复合处理下出现，比对照增加43.4%；移栽后50 d时，烟叶可溶性糖最高值在750 mg·kg-1Pb及100 mg·kg-1Zn复合处理下出现，比对照增加74.2%。

图4 Pb、Zn复合作用对烟叶蛋白质含量的影响Fig.4 Combination effect of Pb and Zn on protein content in tobacco leaf

图5 Pb、Zn复合作用对烟叶蔗糖酶活性和可溶性糖含量的影响Fig.5 Combination effect of Pb and Zn on sucrose activity and soluble sugar content in tobacco leaf

2.6 Pb、Zn复合作用对烟叶抗氧化酶、碳氮代谢相关指标的影响

从表1可以看出，Pb对烟叶抗氧化和碳氮代谢指标均有极显著影响(P<0.01)；而Zn对SOD活性影响不显著。移栽后30 d时，Zn×Pb对烟草叶片的生理指标都有显著影响；但移栽后50 d时，Zn×Pb对SOD和POD活性无显著影响。从方差和结果也可以看出，Pb对烟叶SOD和POD活性影响较大。随着时间的累积，Pb对烟叶抗氧化指标影响大于Zn、Pb×Zn；而Zn对于碳氮代谢指标的影响比Pb、Pb×Zn处理大。

由表2可知，8个生理指标逐步回归方程的F检验均呈极显著影响，线性关系成立。时间是SOD活性与蛋白质含量的主要影响因素；除时间外，Pb为POD活性的主要影响因素，Zn是蔗糖酶的主要影响因素。Zn、Pb及时间对NR酶活性，MDA、脯氨酸及可溶性糖含量均影响极显著。从线性方程的系数可以看出，Zn表现为激活蔗糖酶活性；Pb表现为对POD的激活作用；Zn、Pb皆能促进NR酶活性，使MDA、脯氨酸和可溶性糖含量增加。随着时间的延长，POD和NR活性降低，脯氨酸含量减少。

表1 Pb、Zn复合作用对烟叶抗氧化酶、碳氮代谢影响的方差分析Table 1 Variance analysis of the combination effects of Pb and Zn on antioxidant enzyme, carbon-nitrogen metabolism in tobacco leaf

表2 Pb、Zn复合作用对烟叶抗氧化酶、碳氮代谢影响的线性分析Table 2 Linear analysis of the combination effects of Pb and Zn on antioxidant enzymes and carbon-nitrogen metabolism in tobacco leaf

3 讨论

3.1 Pb、Zn复合作用对烟草抗氧化系统的影响

重金属胁迫下，植物体内的氧化还原平衡容易被打破。本研究中，单因素胁迫下，烟叶中MDA含量和脯氨酸含量均随着Pb或Zn浓度的增加而增加，说明单一Pb、Zn胁迫会损伤烟苗的膜系统，同时脯氨酸增加对受胁迫植株产生保护作用，进一步减缓植株受伤害程度[21-22]。中低浓度Pb与 Zn复合处理表现为协同作用，烟叶MDA和脯氨酸含量随Zn浓度增加而增加，对烟叶的伤害加大；但750 mg·kg-1Pb及100 mg·kg-1Zn复合处理下，表现为拮抗作用，烟叶MDA和脯氨酸含量降低。

重金属浓度不同对植物抗氧化酶系统的影响程度也不同[23]。有研究表明，适度的Pb胁迫能促进植物的SOD和POD活性[24-25]；但阮亚男等[26]研究显示，高浓度的Pb也会抑制烟草叶片愈伤组织中SOD活性。本研究中，单一Pb或Zn胁迫对烟叶SOD和POD活性均表现为低促高抑作用，与前人结果相似。张军等[27]研究发现，Zn、Pb复合污染会抑制黑麦草POD活性，而激活SOD活性。本研究条件下，Pb是烟叶POD活性的主要影响因素。中低浓度Pb(150、450 mg·kg-1)与Zn复合处理下，低浓度Zn能激活烟叶SOD和POD活性，高浓度Zn则抑制抗氧化酶活性；而高浓度Pb(750 mg·kg-1)与Zn复合处理下，SOD和POD的变化趋势则相反。这说明在Pb、Zn交互作用中，酶活性并非单一重金属影响之和，金属离子浓度不同可表现为协同或拮抗作用。

3.2 Pb、Zn复合作用对烟草碳氮代谢的影响

植物在重金属胁迫下，可以通过抗氧化酶消除重金属产生的毒害，达到解毒的目的，一旦抗氧化系统无法抵抗重金属胁迫，植物的碳氮代谢也随之受到影响。NR是植物氮素同化的限速酶，是植物体最基本、最原始的氮代谢调控关键酶，其活性高低影响植物的氮水平[28]。烟草叶片NR活性和可溶性糖含量会随土壤Pb浓度的增加先升高而后下降[29-30]，施Zn能够提高烟草蛋白质含量[31]。本研究也证实了，适量的单一Pb元素能提高烟叶中NR和蔗糖酶活性，增加蛋白质含量和可溶性糖含量。而Pb、Zn复合污染对烟叶碳氮代谢的影响则与抗氧化酶相一致，即适宜浓度的Pb、Zn复合产生拮抗作用，促进烟叶的碳氮代谢；Pb浓度过高、Zn浓度较低或Pb浓度较低、Zn浓度过高时，则会产生协同作用，抑制烟叶的碳氮代谢。从烟叶生长的2个时期来看，Zn主要起激活蔗糖酶活性作用，但是对蛋白质含量的影响不如生长时间显著。

综上所述，单一Pb、Zn对烟草抗氧化酶活性及碳氮代谢具有低促高抑的作用。Pb、Zn复合处理下，金属浓度不同表现为协同或拮抗作用。