红托竹荪腐烂病发病部位侵染真菌的研究*

李建英，吴素蕊，刘春丽，尚陆娥，罗孝坤，刘绍雄**

（1.云南省供销合作社科学研究所，云南 昆明 650221；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

红托竹荪（Dictyophora rubrovolvata M.Zang，et al.）属于担子菌门（Basidiomycota）蘑菇纲（Agaricomycetes）鬼笔目 （Phallales）鬼笔科 （Phallaceae）竹荪属（Dictyophora）[1]，其味道鲜美，口感脆嫩。红托竹荪含有丰富的氨基酸、无机盐、维生素等生物活性物质[2]，硒元素（Se）含量较高，远超富硒的许多农副产品[3-5]，且含有丰富的多糖，具有抗肿瘤、抗氧化等功效[6-10]，是珍稀的食（药）用菌。红托竹荪在市场上认可度较高，具有极大的产业发展潜力，目前人工栽培面积增长迅速，在贵州等地是重点发展的人工栽培食用菌品种。

随着食用菌栽培产业的发展，红托竹荪栽培中的问题日益凸显，近年来比较严重的是红托竹荪菌蛋腐烂病害发生普遍。病害发生初期，菌蛋表面出现水渍状液体，后表皮开始腐烂，感染多种真菌，导致大面积污染，造成畸形菇或者无法出菇，引起减产甚至绝收[11]。国内许多对红托竹荪腐烂病的研究中发现，环境条件对腐烂病发生的影响很大，而没有证据证明红托竹荪腐烂病是由微生物感染引起[12-14]。潘高潮等[15]的研究表明，高温高湿是诱发菌蛋发病的关键，病因是菌蛋长时间处于高温（35℃）条件下引起菌蛋表层的免疫力低下。卢颖颖等[16]的调查也证实，发生腐烂病的大棚温度过高（32℃～36℃），未能及时降温；且在研究中也发现，发生腐烂病但尚未感染真菌的水渍状斑点表皮组织经培养后与正常子实体菌丝形态无差别，说明病变组织未坏死。也就是说，若没有真菌侵染发病部位，尽管发生了腐烂病害产生病斑，后期也不至于大范围减产甚至绝收[16]。

上述研究表明，红托竹荪腐烂病的起因是高温损伤后菌蛋免疫力低下，出现腐烂病斑块，后期因真菌感染引起大范围二次病害，影响出菇。由此可推测后期感染真菌导致二次病害是红托竹荪腐烂病危害的主要因素，菇农在没有明确病因的情况下乱用药，不但没有效果，而且会造成不必要的农药残留。因此，只有明确后期感染的真菌，进行针对性处理，才能更有效地预防后期真菌感染引起二次病害，减少红托竹荪腐烂病发生后产生的经济损失。

通过采集红托竹荪腐烂病害样本，对病害部位感染的真菌进行分离纯化和鉴定，以期探明红托竹荪腐烂病后期引起二次病害的侵染真菌，为腐烂病后期二次病害的针对性防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

样品采集自贵州安龙县红托竹荪栽培基地，感染腐烂病的红托竹荪病害菌蛋，见图1。

图1 感染腐烂病的红托竹荪菌蛋Fig.1 Rotten Dictyophora rubrovolvata infected with fungi

由图1所示，采集地的红托竹荪菌蛋腐烂病较严重，部分菌蛋表面有水渍状斑点，有的菌蛋上已产生不同大小的腐烂病病斑，且病斑上已见明显的白色或灰绿色真菌菌落，真菌感染严重的菌蛋有不同程度的腐烂现象。根据栽培基地的调查发现，病害发生前由于天气变化、通风不畅等原因导致大棚温度有超过32℃的现象，持续时间达48 h，棚内湿度较高；发病前大棚内外蚊虫较多，病害发生后菌蛋腐烂，蚊虫增多。

1.2 腐烂病后期感染真菌菌株分离纯化

在超净工作台中用酒精灯灼烧后的接种针挑取腐烂病发病部位感染的真菌菌丝至PDA培养基中，24℃培养3 d～5 d，观察菌落生长情况。培养至菌落直径2 cm左右时，挑取菌落边缘部位进行纯化，直至获得纯菌株菌落。

1.3 菌株分子鉴定

后期感染真菌菌株分子鉴定采用ITS序列分析法，送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序。序列经过双向校准后在NCBI数据库中进行BLAST比对，下载相似度较高（99%以上）且已发表的序列，以米根霉（Rhizopus oryzae）ITS序列作为外类群，用 MEGA 6.0软件构建 Neighbor-joining（NJ）系统发育树，明确红托竹荪腐烂病后期感染真菌的分类学地位。

2 结果与分析

通过对红托竹荪腐烂病发病部位后期侵染真菌的分离纯化，共得到12个纯菌株，通过ITS序列测定，比对结果见表1，系统发育树见图2。

表1 红托竹荪腐烂病后期侵染真菌序列比对结果Tab.1 Sequence determination results of fungal infection on the rotten Dictyophora rubrovolvata

图2 基于ITS序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由表1和图2可知，分离得到的菌株序列与参考序列相似度均达到99%以上，结合系统发育树分析，12个菌株中有11个菌株（1号、2号、3号、5号、6号、7号、8号、9号、10号、11号和12号）属于木霉属（Trichoderma）真菌，分属于6个种，分别为绒毛木霉（Trichoderma tomentosum）、毛簇木霉 （Trichoderma velutinum）、Trichoderma dorothopsis、贵州木霉（Trichoderma guizhouense）、绿木霉（Trichoderma virens）、哈茨木霉 （Trichoderma harzianum），1个菌株属于青霉属真菌类阿达青霉（Penicillium adametzioides）。

结果表明，引起红托竹荪腐烂病后期侵染的真菌主要是木霉属真菌，且本次研究分离到的木霉属有6个种，纯化的11个菌株中每个种有1个～3个菌株，没有特异性的致病种。因此，木霉属的多种真菌均会引起红托竹荪菌蛋腐烂病后期感染，红托竹荪腐烂病防治措施中加强对木霉属真菌的针对性防治尤为重要。

3 小结与讨论

根据目前的研究报道，培养温度过高是引起红托竹荪菌腐烂病的诱因，栽培过程中，发生腐烂病害的大棚都有温度持续超过32℃的情况发生，菌蛋长时间处于高温条件下引起菌蛋表层免疫力低下，从而发生病害。也有菇农发现栽培过程中有蚊虫叮咬菌蛋后，叮咬部位会发生腐烂病，但尚未有明确的研究报道。不论是何种原因导致的腐烂病，目前均无针对性的治疗措施。因此，导致菇农只有根据目前的研究现状和栽培经验，在红托竹荪栽培的过程中重点关注出菇温度和虫害防治，以减少病害发生的可能性。

开始进行栽培前需考虑出菇时的气候条件，选择合适的栽培时间；必要情况下在搭建大棚时要增加相应的隔热设施，出菇期严格监控棚内温度情况；注意保持通风换气，温度超过32℃时应及时采取降温措施。保持棚内外环境清洁，及时清除周边积水，减少蚊虫滋生，合理使用防蚊网、黄板等设施进行蚊虫阻隔和诱捕。

本次研究表明，木霉属真菌是红托竹荪腐烂病后期侵染的主要真菌。木霉属（Trichoderma）隶属于子囊菌门 （Ascomycota）粪壳菌纲 （Sordariomycetes）肉座菌目 （Hypocreales）肉座菌科（Hypocreaceae），该属真菌为世界性广布种，土壤、植物残体、空气、海洋等都有分布[17-19]。木霉属真菌为嗜温型真菌，适宜在偏酸性、高温高湿的环境中生长，孢子萌发和菌丝生长最适温度为30℃左右，最适相对湿度为95%左右，生长最高温度可达48℃，已有报道称该属的棘孢木霉（Trichoderma asperellum）会在高温条件下引起刺芹侧耳（Pleurotus eryngi）病害[20]。

卢颖颖等[16]的研究表明腐烂病发病部位组织菌丝并未死亡，因此尽管红托竹荪在出菇期发生了腐烂病，若能在产生病斑后及时进行木霉属真菌的针对性防治，可有效减少二次感染，减少腐烂病后期真菌感染导致的大面积减产危害。在红托竹荪的栽培过程中，针对木霉属真菌的生长特性，应加强环境清洁，以减少周围环境中木霉的滋生。如发现腐烂病病斑，应尽快采取通风降温的相应措施，降低棚内温度和空气湿度，在棚内外活动区域撒适量生石灰，创造不适宜木霉孢子萌发和菌丝生长的环境。适量使用疣霉净、多菌灵等对木霉杀伤力较大、且在食用菌栽培中允许使用的农药，有针对性地防治木霉属真菌，有效地降低红托竹荪腐烂病后期木霉属真菌感染造成的二次病害。