银耳多糖提取工艺优化及其对SDS诱导HaCaT细胞损伤的保护作用*

刘光荣，马诗经，韩 萍，车 飙，林 丽，杜志云

[1.无限极（中国）有限公司，广东广州5106233；2.佛山市康伲爱伦生物技术有限公司，广东佛山528200；3.广东工业大学生物医药学院，广东广州510006]

银耳（Tremella fuciformis）为担子菌门（basidiomycete）真菌银耳的子实体，是一种食药兼用真菌，享有“菌中之冠”的美誉，具有滋补生津、扶正固本的功效[1-2]。我国银耳生产主要集中在四川通江、福建古田等地，随着栽培技术的发展，银耳产量大幅提高[3]。

研究证实，银耳多糖为杂多糖[4]，其主链是由α-（1-3）-糖苷键组成的甘露聚糖，主链的2、4、6位上连接有葡萄糖、木糖、岩藻糖及糖醛酸等残基组成的侧链，其活性中心为α-（1-3）-甘露聚糖[5-6]。现代药理学研究表明，银耳多糖具有增强免疫力、抗氧化、抗炎、降血脂、抗辐射、减肥、促进伤口愈合等多种药理活性[7-10]。此外，角质细胞及细胞内的相关蛋白组成了皮肤屏障，可以阻挡外界有害物质（物理、化学等），若皮肤屏障破坏会引起皮肤水分流失、炎症等问题，银耳多糖已被证实具有极强的保湿性能，可作为天然保湿剂应用于改善皮肤屏障损伤[11-13]。

目前，银耳多糖的提取大多采用热水提取法、酶辅助浸提法等。但银耳子实体细胞壁具有蛋白质和多糖结合的结构，难以被破坏，不能充分释放多糖。因此，通过对银耳采用胶体磨处理后再进行热水浸提，以单因素试验与正交试验方法分析优化银耳多糖提取工艺中提取温度、料液比、提取时间的影响并进行工艺优化。同时与目前主要应用的热水浸提法进行多糖提取效果的对比，进一步分析银耳多糖中分子量组成及其对十二烷基磺酸钠（dodecyl sulfate,sodium salt，SDS）诱导的Hacat细胞损伤的修复作用，为其应用到皮肤屏障保护提供科学与试验依据。

1 试验内容

1.1 主要材料、试剂与仪器

银耳子实体干品（产地四川通江），佛山市康伲爱伦生物技术有限公司；银耳多糖，佛山市康伲爱伦生物技术有限公司。

葡萄糖标准品（纯度＞99%），阿拉丁（Aladdin）试剂公司；无水乙醇、浓硫酸、苯酚等（均为分析纯试剂），广州化学试剂厂；蒸馏水，自制。

1510酶标仪，美国Thermo Fisher公司；UV-3600 Plus紫外可见光分光光度计，日本SHIMADZU公司；DK-S22电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；Z326K离心机，德国Hermle公司；KQ3200DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；JMLB-100立式胶体磨，上海科劳机械设备有限公司；2414示差折光检测器，沃特世科技（上海）有限公司；8角度激光散射仪，美国怀雅特技术公司；酶联免疫检测仪1510，美国Thermo Fisher公司。

1.2 试验方法

1.2.1 单因素试验设计

研究不同提取料液比、提取温度、提取时间对银耳多糖提取效果的影响。

1）料液比

固定时间为2 h、温度为100℃，提取2次，探讨不同料液比 （1∶25、1∶35、1∶45、1∶55、1∶65）对银耳多糖提取率的影响。

2）温度

固定液料比为1∶55、时间为2 h，提取2次，探讨不同温度（70℃、80℃、90℃、100℃）对银耳多糖提取率的影响。

3）时间

固定温度为100℃，料液比为1∶55，提取2次，探讨不同时间（1 h、2 h、3 h、4 h）对银耳多糖提取率的影响。

1.2.2 提取工艺

将银耳子实体干品进行研磨，过40目筛。准确称取银耳粉100 g置于烧杯中，按设定的液料比加入蒸馏水，浸泡20 min后置于胶体磨中循环均质处理5 min。按试验设计的提取温度、料液比、提取时间进行提取。提取液经过滤后减压浓缩至一定体积后，经5 000 r·min-1离心10 min。取上层清液加入3倍体积的95%乙醇进行沉定后减压抽滤，沉淀物依次用无水乙醇、丙酮进行洗涤后，冷冻干燥，得银耳粗多糖冻干粉。

1.2.3 银耳多糖提取率的测定

1）葡萄糖溶液配制

称取适量葡萄糖标准品，置于105℃烘箱中烘至恒重后，称取恒重葡萄糖标准品100 mg，在100 mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置于4℃冰箱保存备用。

2）标准曲线绘制

精确移取葡萄糖标准储备液 0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL 分别置于 10 mL 容量瓶中，加蒸馏水定容，配制成浓度分别为0、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、 0.08 mg·mL-1、0.10 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。分别移取上述各葡萄糖标准溶液各1 mL，置于10 mL具塞玻璃试管中，依次加入5%苯酚溶液0.5 mL，浓硫酸2.5 mL，充分涡旋，冷却至室温。另取蒸馏水1 mL，按照上述操作，作为空白对照。将上述溶液分别在490 nm波长处测定吸光度，得回归方程为：

回归方程R2＝0.999 7表明葡萄糖标准品在0～0.10 mg·mL-1内浓度与吸光度呈良好线性关系。

3）银耳多糖提取率测定

将银耳多糖冻干粉溶于蒸馏水中，稀释至浓度为0.1 mg·mL-1，吸取1 mL于具塞试管中，按照标准曲线制作步骤操作，测定吸光度，由标准曲线计算出粗多糖的质量分数，多糖提取率（D，%）的计算公式为：

式中：C为测得吸光度对应的浓度（mg·mL-1）；V为提取液的体积（mL）；B为稀释倍数；0.9为葡萄糖换算成多糖的正交系数；M为原料质量（mg）。

1.2.4 正交试验优化提取工艺

为了进一步确定最佳的提取条件，在单因素试验结果的基础上，以银耳多糖的提取率作为指标，选取料液比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）3个因素进行L9（34）正交试验，具体因素、水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experimen

1.2.5 银耳多糖分子量测定

参考孔令姗等[14]的方法纯化最佳工艺提取的银耳多糖，并且采用高效液相色谱联用多角度激光散射对银耳多糖进行分子量测定[15]。以葡聚糖（dextran）为标准品，色谱条件如下：7.8 mm×300 mm TSK-GELG5000PWXL色谱柱，流动相为超纯水，进样量为 20 μL，流速为 0.6 mL·min-1，柱温为30℃。采用2414示差折光检测器和8角度激光散射仪进行相关的检测。

1.2.6 银耳多糖对SDS诱导的HaCaT细胞损伤后细胞存活率影响试验测定

参考崔乐[16]的测定方法，HaCaT细胞采用完全培养基培养，配制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液，铺于96孔板内，每孔100 μL。置于培养箱37℃、5% CO2条件下培养24 h之后，每孔加入浓度为50 μg·mL-1的SDS溶液，继续培养24 h。用移液枪吸除SDS溶液，用完全培养基将残液清洗干净。洗净后以200 μL/孔分别加入完全培养基（空白对照组）和浓度 1 000.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1的银耳多糖溶液。继续培养24 h之后，用完全培养基清洗干净，洗净后每孔加入MTT溶液100 μL，置于培养箱培养4 h。然后用移液枪吸除MTT溶液后，每孔加入 DMSO溶液150 μL，将96孔板置于振荡器上中速振荡5 min。使用酶联免疫检测仪测量490 nm处的吸光度，细胞存活率（X，%）的计算公式为：

式中：S为试验组吸光度；CK为空白对照组吸光度；YCK为阴性对照组吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取料液比对银耳多糖提取效果的影响

不同提取液料比对银耳多糖提取率的影响情况见图1。

图1 液料比对银耳多糖提取效果的影响Fig.1 Effects of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由图1可以看出，银耳多糖提取率随液料比的增大而提高，在1∶55时银耳多糖提取率基本达到最大值。提取料液比为1∶25时，银耳多糖溶出不充分，银耳提取液较粘稠，过滤难度大。随着料液比的增加，增大了银耳细胞内外的浓度差，使多糖容易溶出；随着液料比的增加达到一定比例时，银耳多糖几乎全部被提取溶出。从节约能耗与后续工艺处理的成本考虑，选择液料比为1∶55。初步分析选择料液比1∶35、1∶45、1∶55作为正交试验的因素水平。

2.1.2 提取温度对银耳多糖提取效果的影响

不同提取温度对银耳多糖提取率的影响情况见图2。

图2 提取温度对银耳多糖提取效果的影响Fig.2 Effects of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

由图2可以看出，银耳多糖的提取率随温度的变化呈增大趋势，在提取温度为100℃时，提取率达到最大值，明显高于70℃、80℃时银耳多糖提取率；而90℃与100℃所得的银耳多糖提取率相差较小。说明提取温度升高，在相同的提取时间内，加快了银耳细胞壁的破碎，促进了银耳中多糖的溶出。因此选择银耳多糖的提取温度为90℃～100℃，初步分析选择提取温度80℃、90℃、100℃作为正交试验的因素水平。

2.1.3 提取时间对银耳多糖提取效果的影响

不同提取时间对银耳多糖提取率的影响情况见图3。

图3 提取时间对银耳多糖提取效果的影响Fig.3 Effects of extraction time on the extraction rate of Tremella fuciformis polysaccharides

由图3可知，银耳多糖提取率随提取时间的延长呈先升高而后降低的趋势。在1 h～3 h之间，银耳多糖提取率随时间的延长而升高，可能是1 h提取时间过短，银耳多糖不能被充分提取；而在相同温度与料液比条件下，提取时间超过3 h可能会促使杂质的溶出量增加而导致多糖的溶解度降低；多糖结构降低不利于银耳多糖活性，因而选择银耳多糖提取时间为2 h，初步分析选择提取时间1 h、2 h、3 h作为正交试验的因素水平。

2.2 正交试验优化试验结果

正交试验设计与结果见表2，正交试验方差分析结果见表3。

表2 正交试验设计与结果Tab.2 Orthogonal array design with experimental results

表3 正交试验方差分析结果Tab.3 Analysis of variance for orthogonal array design

由表2、表3可知，影响银耳多糖提取的因素中，以提取温度的影响最大（P＜0.05），其次为料液比 （P＜0.05）与提取时间。提取的最佳条件是A3B3C2，即银耳子实体经过胶体磨处理后，以料液比1∶55，提取温度100℃，提取时间2 h，提取2次的提取效果最佳。

采用最佳工艺条件与目前工业生产常用的银耳多糖提取工艺进行对比，银耳多糖提取的效果，具体见表4。

表4 不同工艺对银耳多糖提取率的影响Tab.4 Effect on the extraction rate of Tremella fuciformis polysaccharide by different technology

由表4可以看出，将银耳子实体用胶体磨处理后，有助于银耳子实体细胞壁的破碎，促进银耳多糖的溶出，提取率明显高于工业生产所用常规工艺。可以体现本次试验工艺优势，同时工艺的设备简单，适合进行放大生产。

2.3 银耳多糖分子量试验结果

经纯化后的银耳多糖纯化率为99.2%，以不同分子量葡聚糖（10 kDa～2 000 kDa）为标准品，出峰时间曲线的回归方程为：

出峰曲线见图4。

图4 不同分子量葡聚糖与出峰时间曲线Fig.4 The curve of different molecular weight of dextran and peak time

由图4可以看出，出峰时间段为8 min～16 min，提示线性关系良好（R2＝0.992 7）。经过测定，银耳多糖的保留时间为 9.73 min～20.79 min。银耳多糖分子量的比例见表5。

表5 银耳多糖分子量分布Tab.5 Molecular weight distribution of Tremella fuciformis polysaccharide

由表5可知，提取的银耳多糖分子量范围为180 Da～1 231 000 Da，其中低于100 kDa分子量的银耳多糖占82.75%，100 kDa分子量以上银耳多糖占17.25%，说明本次试验最佳工艺条件下所得主要为小分子量的银耳多糖。

2.4 银耳多糖对SDS诱导HaCaT细胞损伤后细胞存活率试验结果

选取一种市售银耳多糖对比自制银耳多糖功效，银耳多糖修复屏障损伤HaCaT细胞的细胞存活率试验结果见图5。

图5 银耳多糖修复屏障损伤HacaT细胞存活率试验结果Fig.5 The results of the survival rate of HaCaT cells by Tremella fuciformis polysaccharide

由图5可以看出，自制银耳多糖在浓度62.5 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、1 000.0 μg·mL-1条件下，Ha-CaT细胞的存活率均大于80%，并且在浓度相同时，自制银耳多糖效果明显优于市售银耳多糖。与模型组相比，在设定浓度下自制银耳多糖均对由SDS诱导损伤的HaCaT细胞具有保护修复作用，在250 μg·mL-1浓度下其效果接近空白组，也为自制银耳多糖损伤HaCaT细胞的最佳作用浓度。结合表5数据，自制银耳多糖多为小分子，而市售银耳多糖可能是大分子量银耳多糖为主，因此自制的银耳多糖更容易透过细胞，发挥修复屏障损伤HaCaT细胞的作用。

3 结论

银耳子实体的细胞壁具双层蛋白质与多糖结合的致密结构，经胶体磨处理后，使得提取溶剂更容易穿透银耳细胞，促进银耳多糖的溶解与释放，从而提高了提取效率。试验结果表明，银耳多糖提取工艺的最优条件是料液比1∶55，提取温度为100℃，提取时间2 h，提取次数为2次。在最优条件下，银耳多糖提取率可达（23.04±0.18）%，比工业生产常规工艺的银耳多糖提取率明显提高。最佳工艺条件下所得主要为100 kDa以下的小分子量银耳多糖，进一步试验发现本次试验所得银耳多糖具有明显的修复SDS诱导损伤HaCaT细胞作用。