高原线虫草重寄生菌的鉴定及培养*

冯云利，陈 惠，陈正启，郑慧华，方 媛，华 蓉，郭 相，孙达锋**

（1.农业农村部食用菌加工重点实验室，江苏 南京 210023；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

多头霉属（Polycephalomyces），属于子囊菌门（Ascomycota）粪壳菌纲（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）线虫草科 （Ophiocordycipitaceae）[1]。多头霉孢梗束初白色，老时为棕色，顶端有黄色粘液分生孢子团，分生孢子小，产孢瓶体末端瓶梗锥形或逐渐变细[1-3]。该属真菌寄主众多，可寄生于膜翅目、鱗翅目、脉翅目、半翅目等昆虫，以及重寄生于其他虫生真菌、黏菌、大团囊菌等[4-5]。

对采自云南省嵩明县梁王山的高原线虫草子实体基部的白色菌丝体进行分离培养，并通过菌丝体的形态学观察与ITS序列分析确定其分类地位。此次研究对了解和保护物种多样性及开发和利用虫草生物资源具有重要的理论意义，也为虫生真菌重寄生菌的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试子实体

2015年7月于云南省嵩明县梁王山采集高原线虫草（Ophiocordyceps highlandensis）子实体，子实体标本保藏于中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所标本馆，编号为KEFI-08742。

1.1.2 培养基

1）PDA综合培养基

马铃薯200 g、蛋白胨1 g、酵母粉1 g、葡萄糖20 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO41 g、琼脂 15 g，水1 000 mL，pH自然。

2）液体培养基

葡萄糖 5 g、蛋白胨 15 g、KH2PO41.5 g、MgSO40.75 g，加水至1 000 mL，pH 自然。

2）固体培养基

配方A：每瓶大米45 g；配方B：每瓶小麦45 g；配方C：每瓶大米22.5 g和小麦22.5 g。各配方添加液体培养基 58.5 mL（料液比为 1∶1.3）。

1.2 试验方法

1.2.1 重寄生菌的分离纯化

用无菌接种针刮取高原线虫草子实体基部白色菌丝，划线于含青霉素的PDA试管，25℃培养，经过多次纯化后得到纯培养菌株，编号JZ025。

牛血清白蛋白(上海市源聚生物科技有限公司)；考马斯亮蓝G-250、Na2HPO4、NaH2PO4、(NH4)2SO4、95%乙醇、85%磷酸均为分析纯。

1.2.2 重寄生菌的形态学鉴定

将分离纯化的重寄生菌打孔转接至PDA平板，25℃培养20 d。进行显微形态拍照，并测量菌丝、产孢结构及分生孢子大小。

1.2.3 分子生物学鉴定

将纯化后菌丝体用试剂盒（TaKaRa生物有限公司）提取DNA，-20℃保存于冰箱。选用引物ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和 ITS5 （5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）进行 ITS 区域扩增[6-7]，引物由华大基因合成。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将有清晰明亮条带的样品交由昆明硕擎生物科技有限公司进行测序，将所测的ITS序列编辑后在NCBI上进行BLAST在线比对，确定其分类地位，构建系统发育树[8]。

1.2.4 重寄生菌的固体培养基筛选

按照1.1.2配置好3种固体培养基，121℃灭菌1 h，冷却后在无菌室紫外灯消毒杀菌30 min；用已灭菌直径5 mm打孔器均匀截取4℃保存的JZ025菌株菌丝块接种，25℃培养，每个处理5个重复。记录菌丝封瓶时间、孢梗束生长情况，培养40d后收取孢梗束进行称重。

2 结果与分析

2.1 高原线虫草重寄生菌形态学鉴定

图1 高原线虫草子实体照片Fig.1 Fruiting bodies of Ophiocordyceps highlandensis

由图1可知，标本KEFI-08742，高原线虫草寄主为鳃金龟，1.5 cm×0.8 cm；形态描述参考李玉等[9-10]的方法，子座长 4.0 cm～8.5 cm，暗褐色至黑色，单生，圆柱形或近梭形，从寄主头部长出，不分支。不孕部分长3.0 cm～4.8 cm，暗褐色，与寄主头部相连；可孕部梭形，1.0 cm～2.5 cm。重寄生菌生长于不孕柄基部，白色，绒毛状。重寄生菌菌落菌丝PDA培养情况见图2。

图2 重寄生菌的菌落PDAFig.2 Colonies of the mycoparasite on PDA

由图2可知，重寄生菌在PDA培养基上生长良好，在25℃下，培养10 d封皿，初期白色，绒毛状；变老时菌丝密集，中央白色带粉红色，后期变为黄色。培养15 d开始长孢梗束，培养20 d可见肉色液体溢出；背面橙黄色，四周颜色逐渐变浅，变为黄色。孢梗束棍棒状，长4 cm～7 cm，初为白色，后变为淡黄色，顶端产生不透明的黄色分生孢子团。其产孢结构和β-型分生孢子，孢梗束顶端的α-型分生孢子和分生孢子链显微特征见图3。

图3 产孢结构及分生孢子显微形态Fig.3 Conidiogenous structure and conidia

由图3a、图3b可知，重寄生菌菌丝透明，具隔，分枝，宽 1.8 μm～3.0 μm，瓶梗顶侧生、单生、对生或互生，矛尖形或细烧瓶型，颈部狭窄，直接产生于气生菌丝和孢梗束外围的菌丝，有时产生于单个分生孢子梗；产孢瓶体细长，（15.0 ～25.0）μm×（0.2～0.5）μm，向基式产生链状的分生孢子。

由图3c～图3e可知，重寄生菌分生孢子无色，透明，单胞，α-型分生孢子卵圆形至长椭圆形，（3.0～4.0）μm ×（1.0～1.5）μm，产生于孢梗束顶端的分生孢子团；β-型分生孢子纺锥形，（3.2 ～4.5）μm×（1.3～2.0）μm，产生于孢梗束柄部和菌落的表面菌丝[3]。

2.2 高原线虫草重寄生菌ITS序列分子鉴定

JZ025为重寄生菌ITS，经BLAST比对，选用另外7条GenBank下载序列应用软件MEGA 7.0基于邻接法构建系统发育树；包括中国多头霉（Polycephalomyces sinensis NR-119928）、枝多头霉（Polycephalomyces ramosus AB925944）、枝多头霉 （Polycephalomyces ramosus MK86325）、Ophiocordyceps neovolkiana HM 856642、Ophiocordyceps neovolkiana HQ215593以及外群序列Cordyceps nipponica JN 943303和 Cordyceps nipponica JN943442。基于 ITS序列构建的邻接法系统发育树见图4。

图4 基于ITS序列构建的邻接法系统发育树Fig.4 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on ITS sequences

由图4可知，JZ025与数据库中Polycephalomyces sinensis NR-119928序列以91%的支持率聚在一支上，且在NCBI上比对的相似度达到98.8%，并与属内其余种相差较大，推测其为同一个种。结合形态鉴定结果将菌株JZ025综合鉴定为中国多头霉（Polycephalomyces sinensis）。

2.3 重寄生菌的固体培养基筛选

菌株JZ025的菌丝在25℃培养40 d后进行观察，其生长情况见图5，在3种固体培养基中的生长状况统计见表1。

表1 不同培养基配方对孢梗束生长的影响Tab.1 Effect on the synnemata growth conditions in different solid cultured medium

图5 固体培养Fig.5 Solid cultured medium

由图5、表1可知，菌丝培养20 d～25 d封瓶，并开始产生孢梗束，JZ025菌株菌丝在配方A中生长得最好，封瓶时间及孢梗束长出时间最短，且菌丝体生物量最大，达4.500 g。

3 结论

多头霉属是1941年Kobeyasi建立的单种无性型属，模式种为美丽多头霉P.formosus Kobayasi[11]。该属真菌存在重寄生现象，即寄生物再寄生于其他寄生物。到目前为止，文献报道多头霉属有28个种，其中16个种报道具有重寄生现象[3]。其中枝多头霉（P.ramosus）重寄生较多，可重寄生于巴恩斯虫草（Cordyceps barnesii）和虫根虫草（Cordyceps entomorrhiza）[12]、下垂虫草 （Ophiocordyceps nutans）[13]。中国多头霉可寄生于蝙蝠蛾科幼虫以及冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）菌核或子座部分，并能够成功获得其培养物[3]。

分离纯化得到的菌株JZ025，通过形态观察，并结合ITS序列数据分析，确定其为中国多头霉；同时获得其纯培养物，并进行最适培养基的筛选。中国多头霉可重寄生于高原线虫草，为重寄生于新真菌。后续试验可开展其成分分析等方面的研究，以加深对该重寄生菌的认识，为其开发利用提供依据。