缝隙连接蛋白43与 B-连环蛋白在皮肤恶性黑色素瘤中的表达及临床意义分析

王娜，李彩霞，袁肖海

上海市皮肤病医院医学美容科，上海 200443

皮肤恶性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）为高度恶性肿瘤，由皮肤组织及黏膜黑色素细胞恶性分化而成。CMM预后较差，且中国近年来发病率呈明显上升趋势。尽管对CMM的临床研究较多，但其发病机制尚不明确。缝隙连接蛋白（connexin，Cx）作为跨膜蛋白家族在细胞间缝隙连接中起到通讯作用，目前已经发现20余种，以Cx43多见且广泛表达。近年来研究表明，Cx43表达能介导细胞间信息传递，与多种肿瘤的发生发展有密切关联。Cx43通过C端域的结合位点与各种蛋白相互作用，可充当肿瘤抑制因子发挥抑癌作用。B-连环蛋白（B-catenin）由B连环蛋白1（catenin beta 1，CTNNB1）基因编码，是一种高保守的多功能分泌型蛋白，参与构成WNT/B-catenin信号通路发挥作用。B-catenin一方面通过结合转录因子促使自身向靶细胞质聚集、核内转移，进而使肿瘤细胞增殖、侵袭能力受影响，另一方面自身可经过相应糖基化修饰与卷曲蛋白结合触发信号级联通路而影响胚胎发育及人体内环境稳态。因此，Cx43、B-catenin的表达与肿瘤发生发展密切相关。目前虽有研究显示Cx43、B-catenin与CMM发生发展密切相关，但相关研究较少，且鲜有在CMM患者中同时检测两种指标表达与CMM发生发展之间的关系研究。故本研究探讨Cx43与B-catenin在CMM中的表达情况，并分析其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年2月至2020年2月上海市皮肤病医院收治的CMM患者的病历资料，每位患者均已取得肿瘤组织和癌旁正常皮肤组织。纳入标准：初次发病；年龄≥18岁；参照相关指南标准，经病理检查确诊为CMM；行手术治疗；术前无抗肿瘤治疗史；临床资料完整。排除标准：伴其他类型恶性肿瘤；伴先天性疾病；伴心、肺等严重器官功能障碍；伴肝肾功能不全；伴严重免疫系统性疾病。根据纳入、排除标准，共纳入75例CMM患者，其中男39例，女36例；年龄39～76岁，平均（57.15±9.76）岁；发病部位：四肢50例，其他部位25例；美国癌症联合委员会（American Joint Committee on Cancer，AJCC）TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期20例，Ⅲ期25例，Ⅳ期14例；肿瘤直径≤4 cm 35例，＞4 cm 40例；伴淋巴结转移30例。

1.2 研究方法

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quan-titative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）法测定

Cx43

相对表达量将组织样本（直径1.0 cm）放于-80℃环境保存，通过RNA提取试剂盒（上海睿时生物科技有限公司）提取总RNA，用焦碳酸二乙酯溶解RNA，使用紫外分光光度计测其浓度和纯度，然后用逆转录试剂盒（上海睿时生物科技有限公司）在由4.0 μl模板、5倍缓冲液 2.0 μl、焦碳酸二乙酯 4.0 μl构成的反应体系中将其逆转录为cDNA，PCR定量反应测定Cx43的表达水平，反应体系为 4.0 μl模板、Premix Ex TaqⅡ2.0 μl、上游引物及下游引物各1.0 μl、焦碳酸二乙酯12.0 μl，在95 ℃下预变性5 min、95 ℃下变性5 s、60℃退火30 s，共循环40次。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参（相对含量为1），根据目的基因和内参计算相对表达量。按本研究中肿瘤组织的

Cx43

相对表达量的中位数0.80为临界值，将患者分为低表达组37例和高表达组38例，分组方法参考有关文献。

1.2.2 免疫组织化学染色法检测 B-catenin将CMM患者的肿瘤组织和癌旁皮肤组织的石蜡切片切为厚3.0 μm的薄片，脱蜡后通过免疫组织化学染色法将标本染色。首先用0.5%高锰酸钾浸泡水洗5～20 min，再用1.0%草酸浸泡2～5 min实现脱色（通过肿瘤组织大小和镜下观察脱色度具体判定），脱色后对抗原热修复25 min，将薄片置于3.0% HO室温下孵育12 min，经小牛血清封闭液在常温下反应15 min后去除封闭液，随后滴加B-catenin免疫组化一抗，1∶500稀释，甩去封闭液封闭，4℃环境下孵化过夜。复温50 min后用链霉亲和素-生物素复合物免疫组织化学剂孵育0.5 h，二氨基联苯胺显色10 min，苏木素再染色5 min后用氨水返蓝、清洗、脱水、固定封片即可镜下观察。

1.2.3 染色结果判定标准B-catenin阳性细胞表现为细胞质或细胞核在镜下可见棕褐色颗粒物，根据阳性细胞百分比和染色强度评分综合判定是否为阳性表达。染色强度评价标准：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性细胞百分比评价标准：无阳性细胞为0分，阳性细胞＜10%为1分，10%～50%为2分，＞50%为3分。阳性细胞百分比和染色强度评分的乘积，0分为B-catenin阴性，≥1分为B-catenin阳性表达。

1.2.4 临床特征收集患者性别、年龄、发病部位、淋巴结转移情况资料均源自病史记录；肿瘤大小通过皮肤镜检查测量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CMM组织与癌旁组织中Cx43相对表达量的比较

CMM组织中

Cx43

相对表达量为（0.769±0.213），明显低于癌旁组织的（1.081±0.236），差异有统计学意义（

t

=33.043，

P

=0.000）。

2.2 CMM组织与癌旁组织中 B-catenin阳性表达率的比较

CMM组织中B-catenin阳性表达率为68.00%（51/75），明显高于癌旁组织的21.33%（16/75），差异有统计学意义（

χ

=33.043，

P

=0.000）。

2.3 不同Cx43、 B-catenin表达情况的CMM患者临床特征的比较

Cx43低表达CMM患者TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、肿瘤大小＞4 cm、淋巴结转移的比例分别明显高于高表达患者，差异均有统计学意义（

χ

=7.090、11.317、11.522，

P

＜0.01）；B-catenin阴性表达CMM患者TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、肿瘤直径＞4 cm、淋巴结转移的比例分别低于阳性表达患者，差异均有统计学意义（

χ

=17.653、5.672、5.402，

P

＜0.05）；不同Cx43、B-catenin表达情况的CMM患者性别、年龄、发病部位比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。（表1）

表1 不同Cx43、 B-catenin表达情况的CMM患者的临床特征（ n=75）

2.4 Cx43、 B-catenin的表达与临床特征的相关性分析

Cx43表达与TNM分期、肿瘤直径、淋巴结转移均呈负相关（

P

＜0.01），B-catenin表达与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移均呈正相关（

P

＜0.01）。（表2）

表2 Cx43与 B-catenin的表达与临床特征的相关性分析

3 讨论

CMM始发于皮肤，由于恶性程度高，转移后迅速蔓延并危及生命，常规化疗效果欠佳，增强肿瘤浸润淋巴细胞杀伤作用是目前的研究重点。细胞缝隙连接通讯可传递免疫信息，Cx43在免疫细胞中高表达，研究表明Cx43可允许抗原交叉呈递进而促使肿瘤浸润淋巴细胞发挥杀伤作用，在肿瘤微环境调节中发挥重要作用。Cx可用于形成连接子，允许代谢物排出和小分子物质交换促进细胞间代谢平衡、细胞外内环境稳定，Cx43作为最为多见的Cx，如果表达出现异常可造成细胞间代谢失衡、细胞外内环境紊乱进而引发细胞出现恶性增殖和分化。WNT/B-catenin通路与肿瘤细胞增殖和侵袭作用有关，B-catenin是WNT/B-catenin重要的节点，可通过与钙黏蛋白作用参与细胞间黏附。研究表明B-catenin表达可下调钙黏蛋白水平，因此B-catenin异常表达会造成细胞间黏附作用减小、松散，进而提高肿瘤转移风险。由此可见，Cx43及B-catenin表达异常与恶性肿瘤发生发展有密切联系。由于CMM发病机制尚不明确，Cx43与B-catenin在CMM中的表达水平及意义研究较少，故本研究重在研究Cx43与B-catenin在CMM中的表达水平，并分析其临床意义。

本研究结果显示，CMM组织中Cx43相对表达量明显低于癌旁组织，CMM组织中Cx43表达与TNM分期、肿瘤直径、淋巴结转移均呈负相关，这与王峻岭等和张冀北等的研究结果相一致。肿瘤组织中肿瘤细胞增殖分化程度高于癌旁组织，肿瘤细胞增殖旺盛却不会调亡的主要原因是免疫反应被削弱，可能原因是Cx43低表达造成抗原呈递作用减弱进而降低肿瘤浸润淋巴细胞杀伤作用，使肿瘤细胞增殖分化不受阻碍，侵袭作用增强，恶性肿瘤发生发展进程加快，肿瘤相对较大且更易发生淋巴结转移。CMM组织中B-catenin阳性表达率明显高于癌旁组织，B-catenin表达与TNM分期、肿瘤直径、淋巴结转移均呈正相关，这与戴云飞的研究结果相一致。正常细胞间黏附作用较强，从而实现信息交流和物质交换，而肿瘤细胞则相反，通过减弱细胞间黏附作用实现细胞脱落，然后发生恶性增殖和转移，可能原因是B-catenin过表达会降低钙黏蛋白水平，从而降低细胞间黏附作用，增加肿瘤细胞脱落和转移风险。此外B-catenin高表达会使WNT/B-catenin通路持续处于激活状态，使通路中下游分子突变，促进肿瘤发生发展，因此恶性程度高、相对较大的肿瘤更易发生淋巴结转移。

综上所述，Cx43在CMM组织中低表达，B-catenin在CMM组织中高表达，且Cx43、B-catenin表达情况与CMM的发生发展密切相关。