卵巢癌早期检测的DNA甲基化标志物研究进展

孔令红，万智毅，刘晓刚

清华大学附属垂杨柳医院病理科，北京 100022

卵巢癌的发病率在全部妇科恶性肿瘤中居第三位，但致死率最高。据2015年中国癌症统计数据，中国每年有5.21万人被诊断为卵巢癌，2.25万人死于卵巢癌。卵巢癌具有很高的异质性，约90%属于上皮性卵巢癌，其中约70%为浆液性，预后较差。早期（Ⅰ期）卵巢癌患者的5年生存率超过90%，然而早期卵巢癌无明显的临床症状，大多数患者很难在早期及时发现，70%以上的卵巢癌发现时已处于晚期，5年生存率不足70%。卵巢癌异质性强、进展较快、缺乏合适的早期检测方法是卵巢癌早期检测的重要挑战。因此，寻找可靠的卵巢癌早期检测标志物具有十分重要的意义。目前，血清糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）是临床中使用最广泛的上皮性卵巢癌诊断及复发监测的标志物。但在早期卵巢癌患者中，其灵敏度不到50%，且特异度不高。很多疾病患者的血清中CA125水平都会升高，如子宫内膜异位、腹膜炎、盆腔炎、子宫肌瘤、肝硬化等，在肺癌与结直肠癌中CA125的表达水平也会升高。因此，单独检测CA125并不适合用于上皮性卵巢癌的早期诊断。美国一项随机对照临床试验[前列腺癌、肺癌、结直肠癌和卵巢癌（Prostate,Lung,Colorectal and Ovarian，PLCO）筛查试验]结果表明，与常规护理组（不接受CA125与阴道超声年度筛查但进行常规的医疗护理）相比，结合阴道超声和CA125进行卵巢癌筛查并不能降低卵巢癌的致死率。英国的卵巢癌筛查试验应用阴道超声与CA125筛查了20万无症状的绝经后女性，发现CA125结合阴道超声检测尽管提高了特异度（99.8%），但是并未显著提高灵敏度。类似于PLCO研究，该研究的随访数据表明阴道超声结合CA125检测并未显著降低卵巢癌的致死率。一些研究应用CA125联合其他血清肿瘤标志物诊断卵巢癌，虽然提高了灵敏度与特异度，但仍不能满足卵巢癌筛查的需求。其中非常有前景的组合是人附睾蛋白4（human epididymis protein 4，HE4）联合CA125检测，但目前美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）仅批准其用于卵巢癌的复发或进展监测。至今临床上并未建立适用于早期卵巢癌检测的肿瘤标志物组合，仍需要大量的研究与验证。本文就卵巢癌早期检测的DNA甲基化标志物研究进展进行综述。

1 DNA突变标志物

癌症基因组研究表明肿瘤细胞的基因组存在大量的遗传变异。在卵巢癌中，大部分样本都存在肿瘤蛋白 p53（tumor protein p53，TP53）基因突变，集中在4～10号外显子。通过检测血浆中的循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）可检测出这些DNA突变。在cfDNA中，一部分为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），它是由肿瘤细胞通过凋亡、坏死等方式释放到血液循环中的DNA片段，携带了肿瘤细胞特异的遗传及表观遗传信息，因此可以用于肿瘤的无创检测。一些研究尝试通过检测血浆、腹腔积液、卵巢囊肿积液等体液中的ctDNA突变进行卵巢癌检测。Krimmel等通过高深度测序在卵巢癌患者的腹腔积液中检测出低频

TP53

突变，然而在健康人的对照样本中也能检出非常低频的

TP53

突变。CancerSEEK试验是一个多中心临床试验，通过ctDNA结合蛋白标志物检测8种恶性肿瘤，结果显示，其在保证特异度为99%的同时，对卵巢癌患者的检测达到了98%的灵敏度，然而大部分患者为晚期患者，只有9例患者为Ⅰ期。早期卵巢癌的ctDNA突变检出率明显低于晚期，即使ctDNA的测序深度在3万乘以上，早期（Ⅰ/Ⅱ期）卵巢癌检测的灵敏度也不足68%。根据GRAIL公司开展的大型队列研究——循环游离基因组图谱研究（the circulating cell-free genome atlas，CCGA）初步报道的结果，在达到99%特异度时，即使ctDNA的测序深度达到6万乘，Ⅰ～Ⅲ期卵巢癌检测的灵敏度也只有67%。由此可见，通过检测ctDNA突变来进行早期卵巢癌的检测达不到较高的灵敏度，并不是进行卵巢癌早期检测的理想途径。其原因在于卵巢癌本身的异质性，并不是所有的卵巢癌组织都存在DNA突变。根据COSMIC数据库的信息，81%的卵巢癌组织样本中存在驱动基因变异；而在高级别浆液性卵巢癌中，只有73%的患者存在

TP53

突变。ctDNA突变检测早期卵巢癌的灵敏度不高还可能是由于早期卵巢癌患者的血浆中ctDNA含量很低，有限的血液样本（一般10 ml）很可能检测不到带有突变信息的DNA片段。另外，DNA突变信息不具备组织特异性，容易受其他肿瘤及疾病的干扰。以TP53为例，很多类型的恶性肿瘤中都存在

TP53

突变，甚至很多非恶性肿瘤人群的体液中也存在低水平的

TP53

突变。最后，高深度测序产生的较高成本也是限制该方法在临床中应用的重要因素。

2 DNA甲基化标志物

与DNA突变不同，DNA甲基化修饰具有组织特异性、变化范围广、潜在灵敏度高等特点，长久以来被认为非常适合作为恶性肿瘤早期检测的标志物。DNA甲基化是表观遗传修饰途径之一，能够引起染色质结构和DNA稳定性发生改变，进而调控基因的转录和表达，与肿瘤的发生发展具有重要联系。在恶性肿瘤发生之前的癌前病变阶段，相较于正常组织细胞，病变组织细胞的基因组已经产生了广泛的DNA甲基化修饰。因此，相对于DNA突变而言，DNA甲基化修饰是肿瘤发生的最早期事件，具有更高的灵敏度与特异度，更适合作为诊断的标志物。在卵巢癌细胞中，叉头框转录因子D3（forkhead box D3，FOXD3）的高甲基化与肿瘤生长抑制有关。部分卵巢癌中乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1）的沉默也是由其启动子区甲基化导致的。除此之外，很多其他基因的表达也由于启动子区的甲基化而受到抑制，包括

DAPK

、

LOT1

、

HOXA10

、

HOXA11

、

CTGF

、

TMS1/ASC

、

PAR4

、

p16

、

SPARC

、

CDH1

、

SFN

、

WT1

等。Melnikov等通过高通量测序方法比较了卵巢癌组织与正常组织的差异甲基化区域，结果发现，包括

BRCA1

、

MLH1

在内的10个基因在卵巢癌组织中高度甲基化，这些基因的组合最高可以达到69%的灵敏度与70%的特异度，然而这些卵巢癌组织样本集中于晚期，其对早期卵巢癌的诊断能力并不明确。尽管许多研究报道了卵巢癌组织中特异的DNA甲基化标志物，然而临床中早期卵巢癌的检测只有通过体液等无创性的检测方式才具有可行性。一些研究已经报道了用于卵巢癌早期检测的血浆DNA甲基化标志物（表1），例如

BRCA1

、

OPCML

、

RASSF1A

、

ESR1

等。Ibanez de Caceres等首次报道了检测血浆中ctDNA甲基化进行卵巢癌诊断的可行性，通过检测

BRCA1

、

RASSF1A

、

APC

、

p14ARF

、

p16INK4a

、

DAPK

等6个基因的甲基化水平，灵敏度为82.0%（41/50），特异度为100%（40/40）。Melnikov等采集了33例中晚期卵巢癌患者与33例健康对照者的血浆样本，通过检测

BRCA1

、

HIC1

、

PAX5

、

PGR

、

THBS1

等5个基因的甲基化水平，达到了85.1%的灵敏度，然而特异度只有61.1%。也有研究仅检测了卵巢癌患者、卵巢良性肿瘤患者和健康对照者的

OPCML

甲基化水平，也实现了非常高的灵敏度与特异度。Giannopoulou等采用甲基化特异性聚合酶链反应（methylationspecificPCR，MSP）分别检测

RASSF1A

和

ESR1

启动子的甲基化水平，检出高级别浆液性卵巢癌的灵敏度分别为62.3%与38.0%。Zhang等采用多重 MSP检测

APC

、

RASSF1A

、

CDH1

、

RUNX3

、

TFPI2

、

SFRP5

、

OPCML

等7个基因的甲基化区域，在41例Ⅰ期上皮性卵巢癌患者的血浆中获得85.3%的灵敏度和90.5%的特异度。Widschwendter等报道了一个与

COL23A1

、

C2CD4D

、

WNT6

相关的3个甲基化标志物组合，通过高通量测序检测血浆中的cfDNA来区分高级别浆液性卵巢癌与健康人群及卵巢良性肿瘤患者，特异度为90.7%，灵敏度为41.4%；并且检测卵巢癌患者临床确诊前2年之内的血浆样本，在特异度为96.9%时，灵敏度为23.3%。

表1 卵巢癌早期检测的DNA甲基化标志物

从以上研究报道可以看出，整体而言，基于cfDNA甲基化检测卵巢癌可以得到较高的特异度与灵敏度，然而不同研究中得到的灵敏度差异较大。由于这些报道基本都使用相同的MSP方法进行检测，所以这种差异主要是由于肿瘤的异质性、样本量较小引起的。整体而言，多基因/区域的甲基化检测一般比单基因/区域的检测得到的灵敏度更高。采用单基因/区域检测获得较高灵敏度的研究很难在大样本的验证中实现，例如

OPCML

，其在卵巢癌组织中的高甲基化检出率一般为33.3%～82.6%，因此，预期其在大量血浆样本的验证中也得到先前报道的接近90%的灵敏度是不现实的。

基于cfDNA甲基化的卵巢癌早期检测也面临着缺乏普遍性的单个标志物、cfDNA含量低引起的稳定性差、灵敏度不足等问题。因此，提高卵巢癌早期检测的准确性，一方面必须检测更多、更普遍的标志物，另一方面必须提高其在cfDNA中检测的灵敏度。Guo等基于基因组甲基化测序的数据定义了甲基化单倍型块（methylation haplotype block，MHB），并通过检测和分析cfDNA中的MHB信息进行恶性肿瘤的早期检测与组织溯源，其信噪比远高于平均甲基化水平分析等方法。该方法称为基于甲基化单体型的非侵入性诊断（methylation haplotyping for non-invasive diagnosis，MONOD）技术，通过高通量测序覆盖全基因组400万个CpG甲基化位点，分析和筛选不同cfDNA样本间差异的MHB。Hong等应用该方法检测cfDNA进行甲状腺结节的良恶性鉴别，灵敏度达到87.0%，特异度为84.2%。Liu等应用该方法检测cfDNA进行胰腺癌的早期检测，灵敏度达到68.4%，特异度为90.4%。研究显示，利用该技术可在血浆样本中检出结直肠癌、食管癌、肝癌、肺癌、胃癌的cfDNA甲基化信号，整体特异度为96%，灵敏度达到88%，甚至在临床确诊前4年的血浆样本中也检出了恶性肿瘤信号。另外，Xu等应用类似的方法检测cfDNA进行肝癌检测，灵敏度＞83%，特异度＞90%。在肠癌的无创检测研究中，类似的方法也取得不错的效果，灵敏度为87.9%，特异度为89.6%。

3 小结

综上所述，由于DNA甲基化具有更好的组织特异性，发生改变的时期更早、范围更广，因此较DNA突变更适合作为恶性肿瘤早期检测的标志物。很多研究已经报道了卵巢癌相关的DNA甲基化标志物。基于MHB的检测方法检测范围广、信噪比高，比较适合cfDNA等微量样本的检测，尤其适合恶性肿瘤的早期检测，能够获得较高的灵敏度与特异度。随着高通量测序的发展，基于MHB的多靶点测序已经在肠癌、肝癌、肺癌等多种恶性肿瘤的早期检测中实现比较理想的灵敏度与特异度。因此，利用基于MHB的多靶点检测进行卵巢癌的早期诊断非常值得探索。