喉癌组织中 p21、Yes相关蛋白的表达情况与喉癌患者术后复发的关系

张勇，张炜，范崇盛

郑州大学附属洛阳中心医院耳鼻咽喉头颈外科，河南 洛阳 471000

喉癌是常见的头颈部恶性肿瘤，尽管手术对喉癌的疗效已被证实，但术后复发仍是临床面临的棘手问题。虽然寻找预测喉癌患者预后的指标非常重要，但尚未发现可以预测喉癌患者术后复发情况的特异性标志物。p21可以减少受损的DNA复制，防止异常细胞增殖，从而抑制恶性肿瘤的发生与发展。研究表明，p21可能是抑癌基因，但在某些条件下，其可以促进细胞增殖，并具有致癌性，其表达主要取决于细胞环境。Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）参与了多种器官的生长和细胞的增殖过程，在维持机体内环境稳态方面发挥着重要作用，被认为与多种肿瘤的发生、发展有关。关于肿瘤组织中p21表达情况的研究已有报道，但关于p21和YAP同时表达情况的研究报道很少。本研究初步探讨喉癌组织中p21、YAP蛋白的表达情况与喉癌患者术后复发情况的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3月至2017年4月郑州大学附属洛阳中心医院行手术治疗的喉癌患者。纳入标准：①符合2014年版《喉癌外科手术及综合治疗专家共识》中关于喉癌的诊断标准；②术前经喉镜、CT、MRI检查确诊，术后经病理学检查证实；③术前未接受放化疗、免疫学治疗；④年龄为19～79岁：⑤临床资料完整。排除标准：①转移性喉癌；②有放化疗史；③长期使用免疫抑制剂。根据纳入和排除标准，本研究共纳入118例喉癌患者，根据复发情况分为复发组（

n

=47）、非复发组（

n

=68）和失访患者3例。复发组中，男41例，女6例；年龄51～79岁，平均（64.8±6.2）岁。非复发组中，男57例，女11例；年龄44～79岁，平均（63.3±7.8）岁。两组患者的年龄、性别比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05），具有可比性。

1.2 免疫组化染色法

切除整块肿瘤后，留取喉癌病灶组织，将所取标本置于4%中性甲醛中固定，常规制作组织石蜡切片，并进行常规免疫组化处理，滴加一抗4℃孵育过夜，一抗的工作浓度为1∶100，孵育后，第2天采用磷酸盐缓冲液洗涤切片，清洗3次，每次10 min，然后滴加二抗进行孵育1 h，再依次进行SABC孵育、二氨基联苯胺显色等，最后使用中性树胶封片，置于显微镜下观察。选择YAP和p21表达阳性的乳腺癌组织切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。观察细胞的阳性表达情况。两种蛋白的一抗、二抗均购自美国Invitrogen公司。

1.3 免疫组化染色结果判定

p21、YAP蛋白阳性表达于细胞核或细胞质和细胞膜，阳性染色呈黄色、棕黄色、褐色。依据染色强度评分：未染色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，褐色、黑色计3分。依据阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞所占百分比≤10%，计1分；阳性细胞所占百分比为11%～50%，计2分；阳性细胞所占百分比为51%～75%，计3分；阳性细胞所占百分比＞75%，计4分。染色程度与阳性细胞所占百分比评分相乘，总分＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 p21、YAP蛋白在喉癌组织中阳性表达情况的比较

复发组患者喉癌组织中p21蛋白的阳性表达率为23.40%（11/47），明显低于非复发组患者的51.47%（35/68），差异有统计学意义（

χ

=9.122，

P

＜0.01）；复发组患者喉癌组织中YAP蛋白的的阳性表达率为80.85%（38/47），明显高于非复发组患者的57.35%（39/68），差异有统计学意义（

χ

=6.936，

P

＜0.01）。

2.2 喉癌患者术后复发情况的单因素分析

两组患者的年龄、性别、吸烟、饮酒、病灶部位、术后化疗情况比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）；复发组TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、分化程度为低分化、有淋巴结转移的患者比例均高于非复发组，差异均有统计学意义（

P

＜0.05）。（表1）

表1 115例喉癌患者术后复发情况影响因素的单因素分析*

2.3 喉癌患者术后复发情况影响因素的多因素分析

以TNM分期、组织分化程度、淋巴结转移情况、p21蛋白表达情况、YAP蛋白表达情况作为自变量，以术后3年复发情况作为因变量，纳入Logistic回归分析模型进行多因素分析，结果显示，TNM分期高、发生淋巴结转移、YAP蛋白阳性表达均是喉癌患者术后复发的独立危险因素，p21蛋白阳性表达率升高是喉癌患者术后复发的独立保护因素（

P

＜0.05）。（表2）

表2 115例喉癌患者术后复发情况影响因素的多因素Logistic回归分析

3 讨论

喉癌是临床常见的头颈部恶性肿瘤，由于一系列原因，其发病率不断升高，临床治疗方法亦不断改进，同时，患者的术后复发情况受到广泛重视，但关于喉癌患者术后检测的特异性指标临床尚存在争议。

Hippo信号通路的作用体现在维持机体生理功能稳态的各个方面，在肿瘤的发生、发展过程中亦发挥了关键性作用。YAP蛋白是Hippo信号通路中的主要效应因子，位于人染色体11q22。有研究发现，YAP蛋白在许多肿瘤中均异常高表达，并能预示肿瘤的转移及预后情况。本研究发现，复发组患者喉癌组织中YAP蛋白的的阳性表达率明显高于非复发组（

P

＜0.01），另外，TNM分期高、发生淋巴结转移、YAP蛋白阳性表达均是喉癌患者术后复发的独立危险因素（

P

＜0.05）。原因是YAP蛋白在喉癌中的表达可能具有积极的调节作用。WNT信号转导通路在肿瘤的进程中发挥着重要作用，当其他因素作用于WNT信号转导通路时，WNT信号转导通路被激活，WNT信号转导通路中B-catenin的降解过程受到抑制，细胞中B-catenin水平很高，其进入细胞核后，激活下游靶基因，促进肿瘤的转移与发展。有研究发现，WNT与Hippo信号通路具有协同作用。因此，推测Hippo和WNT信号通路通过YAP和B-catenin的协同作用，促进了喉癌细胞的增殖，使喉癌细胞于术后易于发生转移，增加了术后复发风险，但由于本研究的样本数量有限，仍需加大样本量进一步探讨。p21蛋白是一种可调控细胞周期的抑制蛋白，对DNA的损伤修复具有一定影响。p21还能抑制CDK复合物的活性，从而导致细胞停滞于G期，具有调节细胞周期的作用。p21阻滞了各种应激环境下的细胞周期，并在肿瘤抑制信号通路中发挥抗增殖效应，从而抑制细胞增殖。然而，在某些条件下，p21可以促进细胞增殖和致癌性，其表达情况主要取决于细胞环境。本研究发现，复发组患者喉癌组织中p21蛋白的阳性表达率明显低于非复发组（

P

＜0.01）；p21蛋白阳性表达率升高是喉癌患者术后复发的保护性因素（

P

＜0.05）。分析其原因是p53的激活可导致下游产物p21的过表达，从而通过灭活CDK2阻止了细胞周期的进程。p21分子具有与p53的结合区，恶性肿瘤组织中p53突变体的表达可刺激p21的异常表达，导致肿瘤细胞恶化。研究发现，肿瘤中p21的表达存在细胞异质性，p21蛋白的稳定性良好，易出现蛋白积累。p21的C端和N端可以与某些部分相互作用，其水平随着细胞增殖周期的变化而变化，可反映细胞的增殖状态。p21过表达表明细胞已在分子水平发生了改变，这种改变通常先表现于细胞形态，这可能是患者术后复发的原因之一，并且是预后预测的关键生物学指标。

综上所述，喉癌组织中p21蛋白表达水平的降低、YAP蛋白表达水平的升高可能会增加喉癌患者术后复发的风险。另外，TNM分期高、发生淋巴结转移、YAP蛋白阳性表达均是喉癌患者术后复发的独立危险因素，p21蛋白阳性表达率升高是喉癌患者术后复发的独立保护因素。p21和YAP蛋白的表达情况可为喉癌的预后预测提供参考，并认为其分子结构水平的异常表达可用于疾病的预后判断。本研究的不足之处在于未对阳性指标进行跟进，在今后的研究中需要对阳性表达的患者采取有效的预测性对症干预措施。