不同分级指数苜蓿干草–小麦秸秆组合对牦牛瘤胃体外发酵的影响

2021-03-11夏洪泽郝文君崔占鸿刘书杰

草业科学 2021年1期

夏洪泽，郝文君，崔占鸿，刘书杰

（青海大学畜牧兽医科学院 / 青海省牦牛工程技术研究中心 / 青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，青海西宁 810016）

牦牛作为青藏高原地区的特有畜种，以放牧养殖为主，但由于青藏高原地区的冷季时间较长，高寒草地牧草产量较低，营养价值变化较大，不能满足该地区冷季反刍家畜自身的营养需要量，致使家畜体重明显降低甚至死亡。近年，牦牛养殖已由全年放牧饲养调整到适度规模舍饲饲养，科学合理地进行牦牛的营养平衡补饲已势在必行[1-5]。

在家畜舍饲养殖过程中，农作物秸秆作为粗饲料已被广泛应用于牦牛的生产，在青海地区小麦秸秆产量巨大，年产量达到46 万t[6]，为充分发挥并利用当地的饲草料资源优势，将小麦(Triticum aestivum)秸秆与苜蓿(Medicago)干草组合，发挥粗饲料间的正组合效应，从而将小麦秸秆与苜蓿干草更好地应用于生产[7-9]。

在粗饲料品质评定上，已有很多体系，如营养值指数体系(NVI)、可消化能进食量体系(DEI)、饲料的相对值体系(RFV)等。2001 年卢德勋根据我国的饲草产量以及供给现状，首先提出饲草分级指数(GI) 的概念[10]。之后经过 GI 理论验证、GI 模型化研究以及补充，逐步趋于理论完善和技术成熟，并在筛选和优化饲草组合等方面得到了广泛的应用[11-14]。

国内外大量研究表明，多种粗饲料进行搭配具有协同作用，可以有效改善瘤胃的内环境，提高饲料的消化利用率[10]。因此本研究以西北地区常用饲草苜蓿干草、小麦秸秆为研究对象，采用体外产气法探究两种粗饲料组合降解率、瘤胃发酵的变化趋势，筛选出最佳分级指数的苜蓿干草–小麦秸秆组合，为发挥青藏高原地区饲草资源优势和提高该地区舍饲牦牛的生产性能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验样品的采集与处理

1.1.1 牧草采集与处理

苜蓿干草、小麦秸秆经65 ℃干燥制成风干样，粉碎后过孔径为0.85 mm 的筛子，自封袋密封保存待测，苜蓿干草、小麦秸秆原样营养水平如表1 所列。

1.1.2 试验动物及其日粮营养水平

本试验的瘤胃液供体为3 头装有瘤胃瘘管、体重为(280.5 ± 15.0) kg 的大通牦牛，饲喂方式为自由采食、饮水，每日饲喂2 次。饲喂日粮的成分和营养组成如表2。

1.2 试验设计

5 种苜蓿干草–小麦秸秆组合的GI 分别为7.03、6.21、5.38、4.55 和3.72，即苜蓿干草与小麦秸秆比例分别为70 ꞉ 30、60 ꞉ 40、50 ꞉ 50、40 ꞉ 60 和30 ꞉ 70，每个组合设定3 个重复，利用体外产气法进行试验，累积发酵48 h。

表 1 小麦秸秆、苜蓿干草的营养水平Table 1 Nutrient levels of wheat straw and alfalfa hay

表 2 日粮成分和营养组成Table 2 Diet composition and nutritional composition

1.3 样品处理方法

1.3.1 苜蓿干草、小麦秸秆及其组合分级指数的计算

分级指数、代谢能(ME)及采食量(VDM I)预测模型参考胡红莲和卢媛[15]的计算公式：

苜蓿干草–小麦秸秆组合GI = 苜蓿干草GI × 相应比例 + 小麦秸秆GI × 相应比例。式中：CP 为粗蛋白，VDM I 为单日干物质采食量，ME 为代谢能，NDF 为中性洗涤纤维，ADF 为酸性洗涤纤维含量，BW 为试验动物体重。

1.3.2 样本制备及瘤胃液的配置

称取组合样品(400 ± 5) mg 装入自制的尼龙袋，待用。将装好样品的尼龙袋放入100 m L 的发酵管内，为保证发酵管气密性，在其内塞上均匀涂抹适量工业凡士林，每个样本设定3 个重复，每次试验做3 个空白对照。

采用Menke 的方法准备人工瘤胃营养液[16]，晨饲前，通过瘤胃瘘管，每头牦牛各抽取1 000 m L 瘤胃液，充分混匀后，在通入CO2的前提下，将人工瘤胃液与瘤胃营养液以2 ꞉ 1 的体积比混合；每个培养管加入(40.0 ± 0.5) m L 混合营养液。排空培养管内全部气体，并记录起始刻度值，立即转入人工培养箱(39 ℃)。

1.3.3 发酵底物、发酵液的收集

分别在发酵3、6、12、24 和48 h 时，将培养管取出，取出装有发酵底物的尼龙袋，投入冰水中以终止反应，并用蒸馏水冲洗尼龙袋，直至无色，终止其发酵，65 ℃烘干，备用；将发酵液收集在15 m L 离心管中，放−20 ℃冰箱中保存，备用。

1.4 体外发酵指标测定

1.4.1 累积产气量测定及产气参数测定

参照夏洪泽等的累积产气量(GP)测定方法[17]，分别在发酵0、3、6、12、24 和48 h 取出培养管并记录刻度值；利用SAS 9.0 软件，根据Ørskov 和M cdonald[18]的产气模型GP = b (l − e−ct)，计算出各体外产气参数。产气模型中，b 代表潜在产气量(m L)；t 代表发酵开始后某一时间(h)；c 代表b 的产气速率常数(%·h−1)。

累积产气量(m L) = 培养管产气量−空白管产气量。

1.4.2 消化能、干物质消失率、中性洗涤纤维消失率及pH 的测定

消化能(DE)可由产气量与常规营养指标估算得出[19]：DE = 0.138 4 × GP + 0.142% × CP + 0.111% ×EE + 2.86；式中：GP 为产气总量，CP 为培养底物的粗蛋白含量，EE 为培养底物的粗脂肪含量。将发酵底物于65 ℃烘箱中烘6 h，烘3 次至恒重根据如下公式计算干物质消失率(IVDMD)、中性洗涤纤维消失率(IVNDFD)。

IVDMD = [(底物重量−残留底物重量)/底物重量] × 100%；

IVNDFD = [(底物NDF 含量−残留底物NDF 含量)/底物NDF 含量] × 100%。

通过台式酸度计(HANNA HI221 型)测定发酵液pH。

1.4.3 氨态氮(NH3-N)浓度和微生物蛋白(MCP)测定

通过比色法[20]利用紫外可见分光光度计(波长625 nm)测定吸光值，通过标准曲线得出发酵液的氨态氮浓度。微生物蛋白的测定依据Wang 等[21]差速离心法，对菌体蛋白进行分离，将分离出的菌体蛋白转移至消化管中，用考马斯亮蓝法进行测定。

1.4.4 挥发性脂肪酸浓度、甲烷(CH4)的测定

参考文献[22-23]，挥发性脂肪酸(VFA) 采用气相色谱仪(日本岛津GC–2014)进行测定，气相色谱条件为，载气：N2(40 m L·m in−1)，分流比40 ꞉ 1，进样量1 μL，进样孔温度：250 ℃，辅助箱温度：250 ℃，气化室温度：250 ℃，FID 检测器温度：250 ℃，色谱柱型号：AT-FFAP 毛细管填充柱(30.0 m × 0.32 μm)。恒流模式，流量2.1 m L·m in−1，平均线速度38 cm ·s−1，柱压11.3 psi (0.1 Mpa)，柱温箱程序升温范围：90～150 ℃。CH4采用气象色谱仪(日本岛津GC–2014)进行测定，气相色谱条件为，载气：N2(40 m L·m in−1)，进样量100 μL，进样口温度：60 ℃，柱温50 ℃，TCD检测器温度：100 ℃，热丝温度：150 ℃。甲烷计算公式为：甲烷产量(m L) = 总产气量 × 甲烷所占百分比。

1.4.5 组合效应指数的计算

单项组合效应值( SFAEI)、综合组合效应指数(MFAEI)参照王旭[10]所使用的方法计算，即SFAEI =[组合后某参数实测值 − (组分一实测值 × 其所占比例 + 组分二实测值 × 其所占比例)]/(组分一实测值 ×其所占比例 + 组分二实测值 × 其所占比例)；MFAEI =∑S FAEI。

1.5 数据处理与分析

试验数据经Excel 2016 进行整理后，通过SPSS 20.0 软件的单因素ANOVA 程序分析。以P ＜ 0.05为差异显著判断标准，以0.05 ≤ P ＜ 0.10 为有变化趋势判断标准。差异显著时，采用Duncan 氏SSR法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 各时间段不同GI 小麦秸秆–苜蓿干草组合在对累积产气量和产气参数的影响

各GI 组合GP 随着培养时间延长而增长(表3)，在3～48 h，GI 为6.21 组合的累积产气量显著高于其他组合(P ＜ 0.05)；各时间点的累积产气量随着GI减小呈现出先升高后降低的趋势，各组合潜在产气量和产气速率常数均差异不显著(P ＞ 0.05)。

表 3 不同GI 小麦秸秆–苜蓿干草组合对累积产气量的影响Table 3 Effects of different GI of wheat straw–alfalfa hay proportions on gas production

2.2 各时间段不同GI 苜蓿干草–小麦秸秆组合对干物质消失率、中性洗涤纤维消失率、氨态氮、微生物蛋白的影响

发酵3 h 时，GI 为6.21 组合与GI 为7.03 和5.38的组合之间IVDMD 差异不显著(P ＞ 0.05) (表4)，但显著高于4.55、3.72 组合(P ＜ 0.05)；发酵48 h 时，GI 为6.21 的组合与GI 为7.03 组合的IVDMD 差异不显著(P ＞ 0.05)，但显著高于GI 为5.38、4.55、3.72的组合(P ＜ 0.05)；发酵6～48 h 的IVDMD 随着GI减小呈现降低趋势，且在GI 为6.21 时达到最大值。

表 4 不同GI 苜蓿干草–小麦秸秆组合对IVDMD、IVNDFD、NH3-N 和MCP 的影响Table 4 Effects of different GI of wheat straw–alfalfa hay proportions on IVDMD、IVNDFD、NH3-N, and MCP and pH

发酵3、12、48 h 时，GI 为7.03 组合的IVNDFD与GI 为6.21 组合的差异不显著(P ＞ 0.05)，但显著高于其他组合(P ＜ 0.05)；发酵6 h 时，GI 为7.03 组合的IVNDFD 显著高于其他组合(P ＜ 0.05)；3～12 h 的IVNDF 随着GI 减小呈现降低趋势，48 h 的IVNDF随着GI 减小呈现出先升高后降低趋势。

发酵3、6、48 h 时，GI 为6.21 组合的NH3-N 浓度与GI 为7.03、5.38 组合之间差异不显著(P ＞ 0.05)，但GI 为7.03、6.21、5.38 组合显著高于GI 为4.55、3.72的组合(P ＜ 0.05)；发酵12～24 h 时，GI 为6.21 组合的NH3-N 浓度与GI 为7.03 组合之间差异不显著，但显著高于其他GI 的组合(P ＜ 0.05)；各时间段的NH3-N 浓度整体随着GI 减小呈现先增加后降低趋势。

发酵3～24 h 时，各组合的MCP 差异不显著(P ＞0.05)，发酵48 h 时，GI 为6.21 的组合与GI 为7.03、5.38 的组合MCP 差异不显著(P ＞ 0.05)，但GI 为6.21 的组合MCP 显著高于GI 为4.55 和3.72 的组合(P ＜ 0.05)；且MCP 随着GI 减小呈现出先小幅度增加再减小的趋势。

发酵12～24 h 时，GI 为6.21 组合的pH 与GI为7.03 组合间差异不显著(P ＞ 0.05)，但显著低于其他组合(P ＜ 0.05)，发酵48 h 时，GI 为6.21 组合的pH 与GI 为7.03 和5.38 的组合间差异不显著(P ＞0.05)，但显著低于其他GI 的组合(P ＜ 0.05)。

2.3 各时间段不同GI 小麦秸秆–苜蓿干草组合在对发酵液VFAs 的影响

发酵3 h 时，GI 为6.21 的组合乙酸浓度显著高于其他组合(P ＜ 0.05) (表5)；发酵48 h 时，GI 为7.03、6.21、5.38 组合的乙酸浓度差异不显著(P ＞ 0.05)，但显著高于GI 为4.55 和3.72 的组合(P ＜ 0.05)。发酵48 h 的乙酸浓度随着GI 减小呈现出先增加后降低的趋势。

表 5 不同苜蓿干草–小麦秸秆组合对乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸的影响Table 5 Effects of different combinations of alfalfa hay–wheat straw on acetic acid, propionic acid, and total volatile fatty acids

发酵3 h 时，GI 为6.21 的组合丙酸浓度显著高于其他组合(P ＜ 0.05)；发酵6～12 h 时，各组合的丙酸浓度差异不显著(P ＞ 0.05)；发酵24 h 时，GI 为6.21 的组合与GI 为5.38 组合的丙酸浓度差异不显著(P ＞ 0.05)，但显著高于GI 为7.03、4.55、3.72 的组合(P ＜ 0.05)；发酵48 h 时，GI 为7.03 和6.21 组合的丙酸浓度差异不显著(P ＞ 0.05)，但GI 为6.21 的组合显著高于GI 为5.38、4.55、3.72 的组合(P ＞ 0.05)；发酵24 和48 h 时，丙酸随着GI 减小呈现出先增加后降低趋势。

发酵3 h 时，GI 为6.21 组合的总挥发性脂肪酸浓度显著高于GI 为7.03、5.38、4.55、3.72 的(P ＜ 0.01)；发酵48 h 时，GI 为6.21 组合的总挥发性脂肪酸浓度与7.03 组合差异不显著(P ＞ 0.05)，但显著高于5.38、4.55、3.72 的组合(P ＜ 0.05)；发酵3 和48 h 时，TVFA 随着GI 减小呈现出先升高后降低趋势。

2.4 各时间段不同GI 小麦秸秆–苜蓿干草组合在对甲烷和消化能的影响

发酵3～24 h 时，GI 为6.21 组合的CH4含量显著高于其他组合(P ＜ 0.05)；各时间段的CH4含量随着GI 减小呈现出先升高后降低趋势，发酵48 h 时各组合无显著差异(P ＞ 0.05)。发酵3～48 h 时，GI为6.21 的组合DE 显著高于其他组合(P ＜ 0.05)；各时间段的DE 随着GI 减小呈现出先升高后降低趋势 (表6)。

2.5 不同GI 苜蓿干草–小麦秸秆组合对综合组合效应值的影响

GI 为7.03、6.21、5.38 的组合在各时间段均产生了正组合效应，GI 为4.55 和3.72 的组合在48 h 产生了正组合效应，但在3～24 h 产生了组合的负效应。各时间段GI 为6.21 组合的MFAEI 均高于其他GI 组合 (表7)。

3 讨论

3.1 不同GI 的苜蓿干草–小麦秸秆组合对累积产气量和干物质降解率的影响

底物发酵程度可通过产气量体现，也可呈现出了瘤胃微生物活跃程度和日粮的可消化性[24-26]。本研究中各组合GP 随培养时间增加而增加，产气速率常数无差异，说明体外发酵处于正常状态，且GP 与IVDMD、IVNDFD 两指标均呈正相关关系。本研究中，各时间点的累积产气量随着GI 减小呈现先升高后降低的趋势，发酵3 h 的 IVDMD 以及发酵3、6、12 h 的IVNDFD 均随着GI 减小呈现下降趋势，说明高蛋白质的苜蓿干草可显著改善小麦秸秆的发酵能力，促进纤维物质的消化，但在各时间段GI 为7.03 组合的IVDMD、IVNDFD 与GI 为6.21 的组合基本上差异不显著，说明苜蓿干草虽能提高小麦秸秆的消化率但也有限度。Silva 等[27]试验结果表明，在只提供秸秆类粗饲料时，会限制微生物的增殖，当提供易消化的纤维饲料时，纤维分解菌首先会附着于优质的粗饲料中进行分解和增殖，同时也提高了秸秆类饲料的利用率，与本研究结果一致。

表 7 不同GI 苜蓿干草–小麦秸秆组合对综合组合效应值的影响Table 7 Effects of different GI of alfalfa hay–wheat straw proportions on multip le factors associative effects index

3.2 不同GI 苜蓿干草–小麦秸秆组合对牦牛瘤胃体外发酵参数的影响

pH 高低是牦牛瘤胃发酵功能、内环境稳态、有机酸生成以及微生物活性的最直接表现[28]。研究显示, 反刍动物瘤胃液pH 正常变动范围为6.0～7.5[29-30]。本研究各GI 组合的pH 为6.80～7.32，均在正常范围内。本研究中，NH3-N 浓度随着GI 的减小，呈现先升高后降低的趋势，其原因是由于苜蓿干草与小麦秸秆中的蛋白质含量差距较大，前者为后者的3.48 倍左右，弥补了蛋白质不足的缺陷，为瘤胃微生物提供了较充足的氮源；而后随着GI 的减小逐渐下降，原因可能是该组合皆为粗饲料组合，其中为瘤胃微生物提供能量的可发酵碳水化合物含量较低，导致NH3-N 逐渐下降，这与杨丽[31]报道的随着营养水平的降低，发酵效果降低的结果基本一致。

MCP 可为反刍动物瘤胃氮主要的来源，且NH3-N浓度又是影响MCP 合成的重要因素[18]；若NH3-N浓度过高会浪费营养源，过低会降低瘤胃微生物活性[32-33]。相关研究指出[34-36]， NH3-N 浓度为0.35～29 mg·dL−1就可为微生物提供充足氮源合成MCP，2～5 mg·dL−1就可满足细菌对纤维降解的需求。本研究中各GI 指数组合的NH3-N 浓度均大于或等于10.87 mg·dL−1，足以满足瘤胃微生物生长的需要。因此，粗饲料纤维的有效降解是合成MCP 的主要限制因素，GI 为6.21 的组合NH3-N 浓度、MCP 浓度均最高，原因可能是GI 为6.21 的组合提供了合适的碳、氮等营养素，使各元素含量达到相对平衡，给予了瘤胃微生物合适的生长环境。

3.3 不同GI 小麦秸秆–苜蓿干草组合对能量的影响

VFA 主要通过底物中碳水化合物的发酵而来，而各GI 组合所含有的碳水化合物的相对比例不同，影响了瘤胃发酵内环境，进而影响瘤胃内挥发性脂肪酸的产生量。在本研究中，粗饲料在瘤胃内发酵产生乙酸比例可以达到总挥发性脂肪酸的59%～63%，而丙酸比例只有19%～22%，且各GI 组合的乙酸产量均高于丙酸产量，这与Petersen 的研究结果[36]较为一致。分析原因为本研究各组合皆为粗饲料组合，均含有大量的纤维素，在发酵过程中纤维素产生的乙酸比例要高。

当苜蓿干草–小麦秸秆组合GI 为6.21 时乙酸、丙酸、总挥发性脂肪酸浓度最高，意味着这一组合中可消化的碳水化合物含量较高。乙酸有利于提高动物的体脂率，丙酸有利于葡萄糖的转化和储存[37-38]，并且丙酸含量对反刍动物的采食量具有一定的影响，因此，对于反刍动物而言，可以通过提高瘤胃发酵过程中丙酸的比例来提高饲料的转化效率。本研究通过改变苜蓿干草–小麦秸秆组合的GI 值提高了丙酸生成量，进而提高人工瘤胃对饲料的降解率，这一结果与孟梅娟等[39]得出随着小麦秸秆比例降低，乙酸、丙酸和总挥发性脂肪酸均降低的结果基本一致。

本研究中GI 为6.21 时粗饲料组合的甲烷产量最高，冯仰廉[30]指出，瘤胃可发酵中性洗涤纤维对甲烷影响很大，而本研究中各组合 IVNDFD 与甲烷产量趋势较为一致。这也充分可以说明各GI 组合中性洗涤纤维含量对产甲烷菌的生长繁殖有一定影响。因此，GI 为6.21 组合的甲烷产量最高的原因可能是这一组合为瘤胃微生物提供了较为合适的生长环境，其中的纤维在瘤胃内降解率提高，导致甲烷产量增多，这一结果与王增林等[40]、郑文思等[41]的随着饲粮NDF 的提高，饲粮体外发酵的甲烷相对产量有所上升研究结果相似。

消化能是日粮消化后真正被机体利用吸收的能量，可以真实地衡量反刍动物对饲料的利用情况，以消化能为基础配制反刍动物饲料配方更能提高饲料的利用效率[42]。发酵48 h 后DE 随着GI 的降低呈现先增大后减小的趋势，分析原因为随着GI变化，各组合为瘤胃微生物提供的营养及环境发生变化，导致消化能随之改变。

3.4 不同GI 苜蓿干草–小麦秸秆组合对MFAEI的影响

王旭[10]以分级指数 GI 和MFAEI 为依据，组合配比不同种类饲草，最大程度地发挥粗饲料间的正组合效应，提高动物的生产性能，从而降低精料的使用量、节约了饲养成本。因此，本研究也采用了MFAEI 评价各GI 组合的组合效应。随着时间的延长各GI 组合的组合效应值逐渐增大；且MFAEI 随着GI 减小呈现先升高后降低的趋势，说明适宜的苜蓿干草与小麦秸秆的比例可以提高组合效应值。分析原因可能是不同GI 小麦秸秆–苜蓿干草组合，其营养组成不一致，进而使微生物存在的发酵环境发生改变，提高了微生物对饲料的利用率，该结果也与张吉鹍[43]得出混合日粮粗饲料 GI 较高时不用增加精料即可获得良好的效益这一结果相近。