野菠萝果中多糖、黄酮与多酚的含量测定 及抗氧化研究

◎ 成宏斌，李晓波，贾笑英，潘晓翠，王代军，王帆林

（海南省农垦科学院，海南 海口 571000）

研究表明，人体的细胞和组织在正常的氧化代谢过程中会产生自由基及活性氧等物质，正常情况下，自由基可促进胶原蛋白的合成、提高抗菌能力和调控基因的表达等。但是，当机体受到外界刺激，如环境污染、饮食过量和烟酒等因素影响时，易引起氧化应激反应，细胞及组织释放大量的自由基，导致氧化损伤[1-2]，从而诱导心脑血管、癌症、帕金森和肿瘤等疾病的发生[3-4]。因此，开发安全、有效的抗氧化剂就显得尤为重要，目前市场的抗氧化剂以人工合成和天然产物提取为主，但人工合成的抗氧化剂有毒副作用、稳定性差和存在安全隐患，所以，来自植物安全无毒和稳定性强的天然抗氧化剂成为人们研究和开发的热点[5]。

野菠萝（Pandanus tectorius Sol.）也称露兜树、露兜簕和山菠萝等，分布于东半球热带和亚热带地区，海南拥有较为丰富的露兜树资源，但常作为绿化和观赏的树种。在民间可作为野果食用，同时也具有重要的药用价值，有平肝清热、去湿利尿的功效，可治疗感冒发热、肝火头疼、痢疾等症状[6-7]。研究发现，野菠萝果中含有多糖、黄酮、多酚和生物碱等多种天然活性成分，对其研究主要集中在降血糖、降血脂和降血压等方面，但是关于野菠萝果中多糖、黄酮和多酚的抗氧化研究较少[8-11]。

本研究以野菠萝果为原料，采用索式提取法提取黄酮、溶剂浸提法提取多糖和多酚3 种天然活性成分，并以DPPH 自由基清除能力和·OH 自由基清除能力为指标，进行多糖、多酚和黄酮的抗氧化活性检测及比较研究，以期为野菠萝果的综合利用提供理论依据，促进相关抗氧化功效食品的研发。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野菠萝果实，产于海南省海口市屯昌县。

芦丁标准品（纯度≥98%）、没食子酸标准品（纯度≥98%）、D（+）-无水葡萄糖标准品（纯度≥98%），均为分析纯，购自上海源叶生物科技有限公司；L（+）-抗坏血酸、六水合三氯化铁、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、30%过氧化氢和二水合草酸，均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、硫酸亚铁七水合物、水杨酸和福林酚，均为分析纯，购自上海源叶生物科技有限公司；苯酚，分析纯，购自广州化学试剂厂；无水乙醇，分析纯，购自广东光华科技股份有限公司；碳酸钠，分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-7502PC 紫外分光光度计，上海欣茂仪器有限公司；电热鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；KE52AA 旋转蒸发器、SHI-Ⅲ型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂；SXT-06 型索式提取器，上海洪纪仪器设备有限公司；20B 风冷式万能粉碎机，河南晟峰瑞桦机械设备有限公司；ME2002E 电子分析天平、ME204E 精密电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DF-101T 集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州予华仪器制造有限公司。

1.3 野菠萝果中黄酮、多糖和多酚的提取

1.3.1 黄酮的提取

采用索式提取法提取野菠萝果中的黄酮。精密称取野菠萝果粉末4.000 g，以80%乙醇为溶媒，固液比为1 ∶25，提取温度为90 ℃，提取4 h，最后将提取液定容至100 mL 容量瓶中，摇匀，即得[12-13]。

1.3.2 多糖的提取

采用溶剂浸提法提取野菠萝果中的多糖。精密称取野菠萝果粉末5.000 g 并置于250 mL 的三角瓶中，以200 mL 的蒸馏水为溶剂，80 ℃水浴浸提2 h，抽滤得澄清液，50 ℃真空旋蒸浓缩后定容至100 mL 容量瓶中，摇匀，即得[14-15]。

1.3.3 多酚的提取

采用溶剂浸提法提取野菠萝果中的多酚。精密称取野菠萝果粉末2.500 g 并置于250 mL 的三角瓶中，量取100 mL 60%乙醇溶液，60 ℃水浴搅拌2 h，抽滤得上清液并定容至100 mL 容量瓶中，摇匀，即得[16]。

1.4 野菠萝果中黄酮含量的测定

1.4.1 芦丁标准曲线的绘制

采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法绘制黄酮的标准曲线[17]，精密称取芦丁10.8 mg 用80%乙醇溶解并定容至50.0 mL，其终浓度为0.216 mg·mL-1，冷藏备用。分别精取标准液0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL和1.8 mL 于10.0 mL 的容量瓶，依次加入80%的乙醇至2.0 mL，再加入0.4 mL 质量分数为5%的亚硝酸钠溶液和0.4 mL 质量分数为10%的硝酸铝溶液，摇匀静置10 min，再加入4.0 mL 质量分数为10%的氢氧化钠溶液，最后加80%的乙醇定容至10.0 mL。用无水乙醇做空白对照，于510 nm 处测定吸光度，用最小二乘法进行线性拟合，得出回归方程及相关系数R2。

1.4.2 黄酮含量的测定

准确量取野菠萝果黄酮提取液2 mL，参照1.3.1芦丁标准曲线绘制方法处理，测得吸光值并带入回归方程，求出野菠萝果中黄酮的含量。

1.5 野菠萝果中多糖含量的测定

1.5.1 葡萄糖标准曲线的绘制

采用苯酚硫酸法绘制多糖的标准曲线[18]，精密称取葡萄糖粉末11.0 mg 置于棕色的容量瓶中，加蒸馏水定容至100 mL，其终浓度为0.11 mg·mL-1。分别量取标准液0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL和0.7 mL 于10 mL 的棕色容量瓶中，依次加入蒸馏水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液2 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸7.0 mL，迅速摇匀，放置10 min，沸水浴加热20 min，放于阴凉处至室温，用蒸馏水做空白对照，于488 nm 处测定吸光度，以多糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行线性回归，得出回归方程及相关系数R2。

1.5.2 多糖含量的测定

准确量取野菠萝果多糖提取液1 mL，参照1.4.1葡萄糖标准曲线绘制方法处理，测得吸光值并带入回归方程，求出野菠萝果中多糖的含量。

1.6 野菠萝果中多酚含量的测定

1.6.1 没食子酸标准曲线的绘制

采用福林-酚比色法绘制多酚的标准曲线[19]，精确称量没食子酸标准品10.0 mg，去离子水超声溶解并定容至100 mL，其终浓度为0.1 mg·mL-1，冷藏备用。分别移取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL没食子酸溶液，去离子水补充至1 mL，分别加入1 N福林酚试剂1 mL，室温反应3 min，在分别加入10%碳酸钠溶液1.0 mL，30 ℃条件下反应30 min，于760 nm处测定吸光度，用最小二乘法进行线性拟合，得出回归方程及相关系数R2。

1.6.2 多酚含量的测定

准确量取野菠萝果多酚提取液1 mL，参照1.5.1没食子酸标准曲线绘制方法处理，测得吸光值并带入回归方程，求出野菠萝果中多酚的含量。

1.7 抗氧化实验

1.7.1 DPPH 自由基清除率的测定

参照GONG Jinyan 等的方法[20]，将野菠萝果供试液（黄酮、多糖和多酚）配制成不同浓度的样品溶液（0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和0.1 mg·mL-1），精密移取2 mL 于试管中，加入0.25 mmol·L-1的DPPH 乙醇溶液2 mL，混匀。室温静置30 min，于517 nm 波长处测量吸光度，记为A1，2 mL 样品溶液与2 mL 无水乙醇混合均匀，测量吸光度，记为A2，2 mL DPPH 乙醇溶液与2 mL 无水乙醇溶液混合均匀，测量吸光度，记为A3，用维生素C（Vc）作为阳性对照，设3 个平行试验，按式（1）计算DPPH 清除率，取均值±标准方差。

1.7.2 ·OH 自由基清除能力的测定

参照CHEN Ling 等的方法并稍作修改[21]，取2.0 mL 不同浓度的野菠萝果供试液（0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.06 mg·mL-1、0.08 mg·mL-1和0.1 mg·mL-1）加入到比色管中，再依次分别加入2.0 mL 浓 度 为8.0 mmol·L-1的FeSO4溶 液，2.0 mL浓 度 为8.0 mmol·L-1的H2O2溶 液 和2.0 mL 浓 度 为8.0 mmol·L-1的水杨酸-乙醇溶液混合均匀，避光在37 ℃水浴30 min，冷却至室温后离心，最后在510 nm测上清液的吸光值，记为Ai，用无水乙醇替换水杨酸-乙醇溶液测定其吸光值为Aj，用蒸馏水替换检测液测定其吸光值为A0。以Vc 作为阳性对照，设3 个平行试验，按式（2）计算·OH 自由基清除率，取均值±标准方差。

1.8 数据处理

采用SPSS20.0 和Origin8.0 进行数据处理、绘图及分析，每个试验均在相同水平条件下进行3 次。

2 结果与分析

2.1 野菠萝果中黄酮、多糖和多酚的含量测定

按照1.3、1.4 和1.5 方法所述标准曲线的绘制，根据硝酸铝-亚硝酸钠比色法、苯酚硫酸法和福林-酚比色法分别测定了野菠萝果中黄酮、多糖和多酚含量的标准曲线，如图1 ～图3 所示。

从上述结果分析得出，黄酮、多糖和多酚的标准曲线线性拟合效果较佳，相关系数R2均大于0.990。因此，从上述方法得出野菠萝果中黄酮、多糖和多酚的含量分别为2.30 mg·g-1、4.32 mg·g-1和1.28 mg·g-1。

图1 黄酮的标准曲线图

图2 多糖的标准曲线图

图3 多酚的标准曲线图

2.2 野菠萝果中黄酮多糖和多酚的抗氧化研究结果

Andriani 等学者发现，野菠萝果不同溶剂的提取物均具有较好的抗氧化能力，但是关于野菠萝果中黄酮、多糖和多酚的抗氧化功能及综合对比的研究还未见报道[22]。因此，本研究以DPPH 自由基清除能力和·OH 自由基清除能力为参考指标对野菠萝3 种活性物质进行抗氧化活性检测。

2.2.1 DPPH 自由基清除能力

DPPH 自由基是一种人工合成、比较稳定的非生理自由基，在乙醇溶液中呈紫红色，当向DPPH 自由基溶液中加入抗氧化物质时，紫红色的DPPH 自由基溶液被还原成黄色，其DPPH 清除率越大，表明抗氧化能力越强，经常用于评价化学物质或食品的抗氧化能力[23-25]。本研究以Vc 作阳性对照，对野菠萝果中黄酮、多糖和多酚3 种活性物质对DPPH 清除能力进行综合测定并比较，试验结果如图4 所示。

图4 三种活性物质对DPPH 清除能力图

从图4 可以看出，野菠萝果中黄酮、多糖、多酚和Vc 均对DPPH 有显著的清除能力，且存在着量效关系，随着浓度的逐渐增加，DPPH 清除能力显著提高。当浓度达到0.02 mg·mL-1时，黄酮、多糖、多酚和Vc 对DPPH 清除率逐渐开始趋于平缓，同时发现，在相同浓度下，可以看出Vc 清除率高于黄酮、多糖和多酚，且在同一浓度下多糖的清除率显著高于黄酮和多酚的清除率，初步说明野菠萝果中多糖具有较强的抗氧化能力，黄酮和多酚具有较好的抗氧化能力。其中野菠萝果多糖的DPPH 自由基清除率的IC50为（0.010±0.288）mg·mL-1，黄酮的DPPH 自由基清除率的IC50为（0.017±0.283）mg·mL-1，多酚的DPPH自由基清除率的IC50为（0.025±0.266）mg·mL-1，进一步说明野菠萝果中黄酮、多糖和多酚有着较好的DPPH 清除能力且多糖的清除效果最佳。

2.2.2 ·OH 自由基清除能力

·OH 自由基具有很强的抗氧化能力且十分活跃，能与大多数物质发生氧化反应导致细胞失活或坏死，抗氧化剂能够有效的清除·OH 自由基的产生量，从而抑制氧化的发生[26-27]。本试验测定了野菠萝果中黄酮、多糖和多酚3 种活性物质对·OH 自由基的清除能力并进行相互比较，以Vc 作阳性对照，其结果如图5 所示。

图5 3 种活性物质对·OH 自由基清除能力图

从图5 结果表明，在试验浓度范围内，3 种活性物质对·OH 自由基清除能力随着浓度的增大逐渐增加，Vc 的·OH 自由基清除率高于多糖的清除率、显著高于黄酮和多酚的清除率。同时，在相同浓度下，黄酮和多酚的清除率效果相差不大，而多糖的清除率显著高于黄酮和多酚的·OH 自由基清除率，说明野菠萝果中多糖具有较强的抗氧化能力，黄酮和多酚具有较好的抗氧化能力。当浓度达到0.1 mg·mL-1，3 种活性物质的清除率均达到最大值，多糖对·OH 自由基清除 率 达 到65.15%，IC50为（0.041±0.229）mg·mL-1，黄 酮 对·OH 自 由 基 清 除 率 达 到21.21%，IC50为（0.400±0.032）mg·mL-1，多酚对·OH 自由基清除率达 到20.23%，IC50为（0.382±0.039）mg·mL-1。由此可见，多糖对·OH 自由基的清除效果高于多酚和黄酮的清除效果，具很强的抗氧化能力。

3 结论

本研究对野菠萝果中多糖、黄酮和多酚进行提取并检测其含量，同时用两种方法测定野菠萝果中多糖、黄酮和多酚的抗氧化活性并进行比较研究。结果表明，野菠萝果中多糖、黄酮和多酚均有着较好的抗氧化活性，且多糖的抗氧化活性较高于黄酮和多酚的抗氧化活性。野菠萝果中多糖清除DPPH 的IC50为（0.010±0.288）mg·mL-1、清 除·OH 的IC50为（0.041±0.229）mg·mL-1，多糖的抗氧化性较高于黄酮和多酚的抗氧化性。综上所述，野菠萝果可作为一种安全、绿色的天然抗氧化物的来源，在食品、化妆品和医药等方面具有较高的应用价值和较好的市场前景。