泻痢康肠溶胶囊微生物限度检查方法适用性试验研究

孙晓朋，曹 莹，王 萌

郑州市食品药品检验所药理室，河南 郑州 450000

泻痢康肠溶胶囊是疗效非常好的一味医院制剂。其含有五倍子、麸煨肉豆蔻、白鲜皮、枯矾、大蒜和醋艾炭这六味中药饮片。其中的五倍子有抗菌解毒等多种生物学功能［1-2］。 白鲜皮对广谱的真菌有抑制作用［3-4］。枯矾对大肠杆菌、痢疾杆菌、金黄色葡萄球菌等都有明显的抑菌作用［5］。大蒜是天然的植物广谱抗菌素［6］，大蒜素的杀菌能力是青霉素的十分之一［7］，对多种细菌、真菌均有抑制和杀灭作用，是当前发现的天然植物中抗菌作用最强的一种［8］。综上所述，泻痢康肠溶胶囊的抑菌性非常强。《中国药典》2015年版四部规定，应先消除供试品的抑菌活性，才能依法检查。因此本文依据四部通则1105、1106、1107具体规则作为检测依据，选择适当的检查方法，建立该药的微生物限度的检查方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

（1）选择仪器：超净工作台（JB-CJ-2FC 蘇州佳寶净化），生物安全柜（LA2-4A1 新加坡艺思高），电热恒温培养箱（HH-B11 500BS 上海跃进）、霉菌培养箱（MJP-250上海精宏），隔水式恒温培养箱（GNP-9160上海精宏），蒸汽灭菌器（SX-700，日本TOMMY公司）。（2）试药：泻痢康肠溶胶囊，规格：每粒装0.4 g，批号：190402、190421、190422。（3）适用性检查用培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号：20190515）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号：20190103）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号：20190305）、麦康凯液体培养基(Mac，批号：20190226）、麦康凯琼脂培养基(MacA，批号：20190123）、肠道菌增菌液体培养基（EE，批号：20190218）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（VRBA，批号：20190105）、RV 沙门增菌液体培养基（RV，批号：20190312）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（XLD，批号：20190301）以上均购于青岛海博。（4）菌种：金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕、铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕、枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕、白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕、 黑曲霉〔CMCC（F）98 003〕、大肠埃希菌〔CMCC（B）44 102〕，乙型副伤寒沙门菌〔CMCC（B）50094〕，以上均购于中国食品药品检定研究院，菌株传代次数均为3代。

1.2 方法

（1）菌液制备： 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至100 ml TSB 中，33℃培养20 h，并稀释成浓度适宜的菌悬液。 接种枯草芽孢杆菌的TSA 斜面培养物至盛有TSA 的茄形培养瓶内，在斜面上均匀涂布，33℃培养7 日，用灭菌水100 ml 分次将芽孢洗下，65℃水浴中加热30 min，并稀释成浓度适宜的菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至100 ml SDB 中，25℃培养48 h，并稀释成浓度适宜的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至SDA上，23℃培养7天，用0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱制成适宜浓度的菌悬液。（2）计数方法的适用性试验（回收试验）：供试品溶液的制备：取供试品10 g，加pH6.8 无菌磷酸盐缓冲溶液至100 ml，置45℃水浴中，摇匀，即为1:10 的溶液，同时制备1：100，1：1000的供试品溶液。试验组（供试品溶液＋菌液）：需氧菌计数（供试品溶液稀释法）：取1∶1000的供试品溶液9.9 ml、5 份，分别加入各试验菌液0.1 ml，混匀，使1.0 ml 供试品溶液中含菌量不大于100 cfu。分别取3.0 ml加菌后的供试品溶液，等量分注3个平皿内，倾注TSA，培养。 霉菌及酵母菌检查（供试品溶液稀释法）：取1∶100供试品溶液9.9 ml、2份，分别加入各试验菌液0.1 ml，使1.0 ml 供试品溶液中含菌量不大于100 cfu。分别取3.0ml 加菌后的供试品溶液，等量分注3 个平皿内，倾注SDA，培养。供试品对照组（测供试品本底菌数）：取1:1000、1:100的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。菌液对照组（测定所加的试验菌数）；取各菌悬液0.1 ml，分别注入平皿中，每种试验菌平行制备3个平皿。

2 结果

由表1 看出，需氧菌总数计数与霉菌和酵母菌总数计数法中试验菌种的回收比值均在0.5～2.0的范围内。

表1 需氧菌、霉菌及酵母菌回收率测定结果

2.1 控制菌检查方法的适用性试验

供试品溶液制备；取计数方法适用性项下制备的1:10溶液，用于控制菌检查方法适用性的验证。

2.2 大肠埃希菌检查方法的适用性试验

（1）增菌培养： 取1:10的供试品溶液10 ml及大肠埃希菌菌液（不大于100 cfu），加入100 ml TSB 中，培养18 h。（2）选择和分离培养：取上述TSB 培养液1 ml，接种至100 mlMac 中，43℃培养24 h。取Mac 培养物划线接种于MacA上，33℃培养18 h，观察，见表2。

表2 大肠埃希菌检查方法的适用性试验结果

2.3 耐胆盐革兰阴性菌检查方法的适用性试验

（1）预培养： 取供试品10 g，加TSB 至100 ml，摇匀，在22℃培养2 小时。（2）选择和分离培养：取1:10 的供试品溶液预培养液2 ml，分别接种至2 支15 ml 的EE 中，其中一支加入大肠埃希菌菌悬液（不大于100 cfu），另一支加入铜绿假单胞菌菌悬液（不大于100 cfu），33℃培养24 h。取上述培养液分别划线接种于VRBA 上，33℃培养18 h，观察，见表3。

表3 耐胆盐革兰阴性菌检查方法的适用性试验结果

2.4 沙门菌检查方法的适用性试验

（1）增菌培养：取供试品10 g 及乙型副伤寒沙门菌菌液（ 不大于100 cfu），加入200 ml TSB 中，培养18 h。（2）选择和分离培养；取上述TSB 培养液0.1 ml，接种至10 mlRV中，33℃培养18 h。取少量RV培养物划线接种于XLD上，33℃培养18 h，观察，见表4。

表4 沙门菌检查方法的适用性试验结果

3 讨论

该药主要由植物的根、皮、动物及矿物组成，本来微生物污染情况就不容易控制，同时又因为该药中含有五倍子、白鲜皮、枯矾、大蒜等这些抑菌性很强的中药饮片，而微生物限度检查计数方法适用性试验和控制菌检查方法适用性试验需要在药物抑菌作用尽可能被降低或者说是达到无抑菌的条件下进行，这给试验带来很大困难。当然采用薄膜过滤法是比较经典的去除抑菌性的一个非常有效的方法，但是我们此次试验的对象是中成药，无法像化学药一样在合适的稀释液中溶解或均匀分散，因此在最开始的取样环节就带来很大的困难。比如取样的时候如果只取上清液，会造成取样不均衡，结果不具有代表性；即使是充分混匀后快速取样，药物残渣会堵塞滤膜，给过滤带来很大的困难。即使是完成过滤，在培养观察的时候，由于药物残渣附着在滤膜上，菌落生长情况也非常不容易观察，不利于后续结果准确性的保证。因此，稀释供试品溶液和增加培养基体积的方法，是最好的选择。

本研究经过适用性试验，建立了泻痢康肠溶胶囊的微生物限度检查方法，最终得出结论：需氧菌总数和霉菌和酵母菌总数计数法采用的是供试品溶液稀释法，需氧菌总数检查时，供试品稀释到10-3，霉菌和酵母菌总数检查时，供试品稀释到10-2；大肠埃希菌采用的是常规法；耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌采用的是增加培养基体积的方法，耐胆盐革兰阴性菌检查时，培养基体积增加至15 ml，沙门菌检查时，培养基体积增加至200 ml。采用上述方法，回收比值均在0.5～2范围内，该方法成立。