绿叶蔬菜中活性成分对亚硝化反应抑制作用的比较研究

卢 强

（新干县农业农村局，江西 吉安 331399）

随着人们生活水平的提高，越来越多的人认识到健康饮食的重要性。良好合理的健康饮食是保证人体健康的关键。健康饮食的关键是平衡饮食，即适量摄入各种不同食物，也就是说，我们不仅仅要吃鱼、肉、蛋等高蛋白的食物，还应该食用蔬菜之类的膳食纤维高的食物。膳食纤维是健康饮食不可缺少的，纤维在保持消化上起着非常重要的作用，摄取足够的纤维也可以预防各种疾病，如心血管疾病、癌症等。其实蔬菜中不仅含有丰富的膳食纤维，也含有许多活性成分，如还原糖、维生素C、多酚等。其中，还原糖主要成分是葡萄糖和果糖，是非常好的可再生糖质资源[1]；多酚类物质有防治肿瘤、冠心病和骨质疏松的作用[2]；维生素C是维持人体正常生理功能的重要化合物，可以促进人体胶原蛋白的合成及伤口愈合，降低毛细血管脆性，改善心肌功能，还具有增强机体抵抗力及防癌效果[3]，维生素C在体内不能合成，主要从新鲜果蔬中摄取[4]。

N-亚硝基化合物是一种具有强致癌作用的化合物。在如今已研究的近300种N-亚硝基化合物中有90%的化合物具有致癌性[5-6]。亚硝酸盐和胺类物质广泛存在于食物中或者在人体新陈代谢中产生[7]，在人体代谢过程中，尤其是在胃液中容易变成亚硝胺。所以清除亚硝酸盐和阻断亚硝胺合成是一种有效预防癌症的重要方法之一。本实验就是研究绿叶蔬菜中活性成分对清除亚硝酸盐的作用效果以及对亚硝胺合成的阻断效果。其中，绿叶蔬菜采用的是市场上普遍存在的蔬菜，如韭菜、芹菜、小白菜、菠菜。希望通过这个实验可以为人们找到简单实用的预防癌症的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验材料：市场上的新鲜蔬菜，分别为芹菜、韭菜、小白菜、菠菜。

试剂：斐林甲液、斐林乙液、乙酸锌溶液、亚铁氰化钾、葡萄糖标准溶液、抗坏血酸、2，6-二氯靛酚钠盐、2%草酸、白陶土、Folin-ciocalteu试剂、亚硝酸钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、对氨基泵磺酸、盐酸萘乙二胺、二甲苯、α-萘胺、碳酸钠。

主要仪器：

BS224S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司

可调电炉：南通市长江光学仪器有限公司

离心机：上海安亭科学仪器厂

HH数显恒温水浴锅：常州赛普试验仪器厂

紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司

超声提取机：宁波新芝生物科技股份有限公司

移液器：Thermos

1.2 试验方法

1.2.1 绿叶蔬菜中还原糖含量的测定——直接滴定法

（1）绿叶蔬菜汁的制备

用天平称取约10g不同种类绿叶蔬菜，放入研磨钵中研磨充分后转入100ml容量瓶中，加50ml水，摇匀后加入5ml乙酸锌溶液，摇匀，加入5ml亚铁氰化钾溶液，加水定容，在超声提取机下30min，用滤纸过滤，滤液作为样液。

（2）测定原理

在加热条件下，用次甲基蓝作指示剂，滴定标定过的斐林试剂，还原糖将溶液中的二价铜还原成氧化亚铜。以稍过量的还原糖使次甲基蓝指示剂褪色作为终点。根据试样溶液消耗体积，计算还原糖量。

（3）测定方法

吸取5.0ml斐林试剂及5.0ml乙液，置于150ml锥形瓶中，加水10ml，加入玻璃珠2粒，加入样液10ml，从滴定管滴加比预测体积少1ml的标准葡萄糖溶液至锥形瓶中，使其在2min内加热至沸，趁沸继续以每两秒1滴的速度滴定，直至蓝色刚好褪去为终点，记录样液消耗体积，同法平行操作3份，得出平均消耗体积。

试样中还原糖（以葡萄糖计）的含量为：

式中：还原糖（%）-每100g试样中还原糖（以葡萄糖计）所含百分比；A-10ml斐林试剂（甲、乙液各5ml）相当于葡萄糖的质量，mg；m-试样质量，g；V-测定时平均消耗试样溶液体积，ml。

1.2.2 绿叶蔬菜中维生素C含量的测定——2，6-二氯靛酚法

（1）绿叶蔬菜汁的制备

称取切碎的果蔬样品10g，放在研钵中加2%草酸溶液少许研碎，注入100ml容量瓶中，加2%草酸溶液稀释至刻度，过滤备用。如果滤液有颜色，在滴定时不易辨别终点，可先用白陶土脱色、过滤，或用离心机沉淀备用。

（2）测定原理

抗坏血酸有还原糖和脱氢型两种，还原型抗坏血酸分子结构中有烯醇（COH=COH）存在，故为一种极敏感的还原剂，它可失去两原子氢而氧化为脱氢型抗坏血酸。染料2，6-二氯靛酚钠盐作为氧化剂，可以氧化抗坏血酸，而其体身亦被还原成无色的衍生物。

（3）测定方法

吸取滤液10ml于100ml三角瓶中，加水30ml，用已标定过的2.6-二氯靛酚钠盐溶液滴定，至桃红色15s不褪为止，记下染料的用量。吸取2%草酸溶液10ml，用染料作空白滴定记下用量。

计算公式：

式中：W-100g样品含的抗坏血酸毫克数；V-滴定样品所用的染料毫升数；V1-空白滴定所用的染料毫升数；A-1ml染料溶液相当的抗坏血酸毫克数；B-滴定时吸取的样品溶液毫升数；b-样品液稀释后总毫升数；a-样品的克数。

1.2.3 绿叶蔬菜中多酚含量的测定

（1）绿叶蔬菜汁的制备

称取绿叶蔬菜约20g，弄碎放入马弗炉中4h，待冷却后研成粉状，称取1g于100ml容量瓶中，用乙醇水溶液定容，静止，用滤纸过滤，滤液备用。

（2）测定原理

以没食子酸为主的多酚类化合物在碱性溶液中可将钨钼酸还原成蓝色化合物，该化合物在760nm处有最大吸收，且吸收值与多酚化合物含量成正比，以没食子酸为标准物质，标准曲线法得出样品溶液的溶度，再计算多酚含量。

（3）测定方法

精密吸取4种样品溶液0.5ml分别于50ml容量瓶中，加入25ml蒸馏水，精密吸取2.5ml Folin-ciocalteu试剂于容量瓶中，再精密加入7.5ml 20%的碳酸钠溶液，摇匀后定容，于30℃反应2h。以空白溶液为参比，在760nm波长处测定4种样品溶液的吸光度。由吸光度值从标准曲线上查出样品溶液的浓度C，按以下公式计算出样品的多酚含量。

式中：C-吸光度值从标准曲线上查出样品溶液的浓度，mg/ml；m-样品质量，g。

1.2.4 绿叶蔬菜清除亚硝酸盐的测定

（1）绿叶蔬菜汁的制备

称取不同种类蔬菜10g，用液氮研磨充分后，装入100ml容量瓶，用蒸馏水定容，用超声提取机提取30min，放入冰箱过滤。

（2）测定方法

分别吸取各种滤液 0、1、2、3ml于 50ml的容量瓶中，加入pH3.0的0.5mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液2ml、5μg/ml的亚硝酸钠标准溶液1.5ml，然后加蒸馏水至10ml，加入0.4%的对氨基苯磺酸2.0ml，混匀，静置3～5min，后各加入1.0ml的0.2%盐酸萘乙二胺，加蒸馏水至50ml，混匀，静置15min，在波长538nm下测定吸光度。用亚硝酸钠标准曲线的回归方程算出亚硝酸钠的残留量，计算清除率。

式中：No为空白管的亚硝酸钠残留量，μg/ml；N1为样品管的亚硝酸钠残留量，μg/ml。

1.2.5 绿叶蔬菜模拟人体胃液条件下亚硝胺合成阻断率的测定

分别吸取各种滤液1、2、3ml于25ml试管中，加入pH3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 10.0ml、1mol/l NaNO2溶液1.0ml、1mol/L的二甲胺溶液1.0ml，加入蒸馏水至25ml，在37℃下恒温1h。用移液管吸取1.0ml上述溶液至25ml小烧杯中，加入质量分数0.5% NaCO3溶液0.5ml，于紫外分析仪上（选用254nm波长）照15min。取出后加入质量分数1%对氨基苯磺酸1.5ml，再加入质量分数0.1%α-萘胺1.5ml、蒸馏水0.5ml，摇匀，静置15min。在最大吸收波长525nm处测定吸光度，计算阻断率。

式中：Ao为未加样液时的吸光度（以缓冲液为参比溶液）；A1为加入样液时的吸光度（以相同样液为参比溶液）。

2 结果与分析

2.1 绿叶蔬菜活性成分百分比

绿叶蔬菜活性成分百分比见图1。可以从图1看出芹菜、韭菜、小白菜、菠菜的还原糖含量、多酚含量、维生素C含量。其中，可见韭菜中还原糖含量最高达到12.17%，芹菜次之3.19%，小白菜和菠菜最少分别是2.74%和2.79%；多酚含量小白菜最高，其含量达4.14%，菠菜含量也达到3.44%，芹菜达到3%，最少的是韭菜2.57%；维生素C含量菠菜>小白菜>韭菜>芹菜，菠菜、小白菜、韭菜、芹菜含量分别为32.54%、28.18%、21%、12.21%。

图1 绿叶蔬菜活性成分百分比

2.2 绿叶蔬菜汁清除亚硝酸盐的测定

从表1可以看出，不同蔬菜汁对亚硝酸盐的清除作用明显不同，可见，芹菜汁和韭菜汁在实验的溶度范围内对亚硝酸盐不具有清除作用（可能是因为其他原因导致对亚硝酸盐的清除作用效果不明显）。而小白菜和菠菜在溶度为0.1%时对亚硝酸盐的清除作用效果不明显，在溶度为0.2%、0.3%的时候均对亚硝酸盐具有清除作用，其中小白菜汁的清除作用会随着溶度的升高而增大，在溶度为0.2%时对亚硝酸盐的清除率为1.43%，在溶度为0.3%时对亚硝酸盐的清除率为2.86%。菠菜汁在溶度为0.2%、0.3%时对亚硝酸盐的清除作用都为0.71%。因此，可以得出不同蔬菜种类对亚硝酸盐的清除率显著水平不明显。

表1 4种蔬菜汁对亚硝酸盐的清除作用的方差分析

2.3 绿叶蔬菜汁阻断亚硝胺合成的阻断率测定

从表2可以看出，不同蔬菜汁均对亚硝胺合成的阻断作用结果。其中菠菜汁对亚硝胺合成的阻断作用效果不明显，而芹菜、韭菜、小白菜这三种蔬菜汁对亚硝胺合成的阻断作用效果较明显。小白菜和芹菜这两种蔬菜汁对亚硝胺合成的阻断作用效果随着溶度的升高而阻断率增大，小白菜汁在溶度为0.3%的时阻断率最大，达到30%。从表2可以得出阻断率显著水平：小白菜>芹菜=韭菜>菠菜。可以选择小白菜、芹菜、韭菜三种蔬菜判断蔬菜汁与亚硝胺合成的抑制作用的相关性；选择效果最好的溶度0.3%。

表2 4种蔬菜汁对亚硝胺合成的阻断作用的方差分析

2.4 绿叶蔬菜中活性成分与清除率、阻断率的相关性

2.4.1 绿叶蔬菜对亚硝酸盐的清除作用效果

从以上数据可以得出，本次实验中的绿叶蔬菜芹菜、韭菜对亚硝酸盐的清除作用没有效果。从表1可以看出，不同蔬菜汁对亚硝酸盐的清除作用明显不同，可见，芹菜汁和韭菜汁在实验的溶度范围内对亚硝酸盐不具有清除作用（可能是因为其他原因导致对亚硝酸盐的清除作用效果不明显），而小白菜汁和菠菜汁在溶度为0.1%时对亚硝酸盐的清除作用效果不明显。小白菜汁和菠菜汁在溶度为0.2%、0.3%时均对亚硝酸盐具有清除作用，其中小白菜汁的清除作用会随着溶度的升高而增大，在溶度为0.2%时对亚硝酸盐的清除率为1.43%，在溶度为0.3%时对亚硝酸盐的清除率为2.86%。菠菜汁在溶度为0.2%、0.3%时对亚硝酸盐的清除作用都为0.71%。因此，判断这4种蔬菜与清除作用没有一定的显著关系，也就是说，不能判断蔬菜中活性成分与清除率的相关性。

2.4.2 绿叶蔬菜对亚硝胺的阻断作用效果

从图1和表2可以得出，绿叶蔬菜都对亚硝胺的阻断作用有效果。

（1）绿叶蔬菜中多酚含量与阻断率的相关性

从图1，表2可以看出，蔬菜中多酚含量与阻断率有明显的线性关系（菠菜的阻断率可能受其他因素影响，在此无明显线性关系），韭菜、芹菜、小白菜多酚含量分别为2.57%、3%、4.14%，而韭菜、芹菜、小白菜汁溶度在0.3%时阻断率分别为13.33%、23.57%、30%，随着蔬菜中多酚含量的增加，蔬菜汁对亚硝胺合成的抑制作用也明显增强。因此，可以得出韭菜、芹菜、小白菜中多酚含量与溶度在0.3%时阻断亚硝胺合成的阻断作用线性关系是成正相关的。也就是说，阻断亚硝胺合成的阻断作用会随着多酚含量的增大而阻断率提高，可以得出，吃多酚含量高的蔬菜可以预防癌症，且多酚含量越高预防癌症效果越明显。

（2）绿叶蔬菜中还原糖含量与阻断率的相关性

从图1，表2可知，韭菜、芹菜、小白菜还原糖含量分别为12.17%、3.19%、2.74%，而韭菜、芹菜、小白菜汁溶度在0.3%时阻断率分别为13.33%、23.57%、30%，随着蔬菜中还原糖含量的减少，蔬菜汁对亚硝胺合成的抑制作用逐渐增强。因此，可以得出绿叶蔬菜中还原糖含量与亚硝胺合成的抑制作用有明显的负相关性。阻断亚硝胺合成的阻断作用会随着还原糖含量的减少而阻断率升高，吃还原糖含量低的绿叶蔬菜可以预防癌症且还原糖含量越低预防癌症效果越明显。

（3）绿叶蔬菜中维生素C含量与阻断率的相关性

从图1可以得出，小白菜、韭菜、芹菜维生素C含量分别为28.18%、21%、12.21%，从表2也可以得出小白菜、韭菜、芹菜汁溶度在0.3%时对亚硝胺合成作用的阻断率分别为30%、13.33%、25.57%。小白菜维生素C含量最高，小白菜汁对亚硝胺合成作用的阻断率也最大；韭菜维生素C含量第二高，但是韭菜汁对亚硝胺合成作用的阻断率却是最低的；芹菜维生素C含量最低，但芹菜汁对亚硝胺合成作用的阻断率却排第二。因此得出结论：蔬菜中维生素C成分对亚硝胺合成作用没有相关性。也就是说，蔬菜中维生素C含量的高低与预防癌症效果的好坏没有一定的关系。

3 结论

本研究测定了绿叶蔬菜的还原糖、多酚、维生素C以及绿叶蔬菜汁对亚硝酸盐的清除作用和对亚硝胺合成的阻断作用。本实验结果表明：绿叶蔬菜汁对亚硝酸盐的清除率没有明显的相关性，而绿叶蔬菜中多酚含量和还原糖含量对亚硝胺合成的阻断作用有明显的相关性，维生素C含量对亚硝胺合成的阻断作用没有一定的相关性。其中，绿叶蔬菜对亚硝化反应的抑制作用为：小白菜>芹菜=韭菜>菠菜，并且绿叶蔬菜中多酚含量对亚硝化反应的抑制作用呈正相关；绿叶蔬菜中还原糖含量对亚硝化反应的抑制作用呈负相关。因此，在生活当中，我们应该多食用多酚含量高、还原糖含量低的蔬菜，可以有效地阻断亚硝酸盐在人体中的沉积，达到身体健康的目的。