观赏辣椒果实花青素提取及果色相关性分析

郭咏梅，段旭东，白健君，王军娥

（山西农业大学 园艺学院，山西 太谷030801；山西省设施蔬菜提质增效协同创新中心，山西 太谷030801）

观赏辣椒（Capsicum frutescensvar.fasciculatum），茄科（Solanaceae）辣椒属（CapsicumLinn.），是典型的观果类蔬菜，具有极高的观赏价值，其果型奇特，果色丰富，更具有适应性强、易栽培、美化环境、净化空气等特点，受到广大园林工作者以及消费者的喜爱。目前，观赏辣椒在花坛，花境，以及家庭园艺中广泛应用［1］。

辣椒已被证实含有大量有益于人类身体健康的物质，包括辣椒素、类胡萝卜素、维生素C、类黄酮等［2］。紫色观赏辣椒色彩鲜艳，且无毒可食用，富含花青素。花青素是类黄酮物质的衍生物之一，是一种典型水溶性色素物质［3］。辣椒中主要的花青素物质为飞燕草素-3-反式香芸豆素-葡萄糖苷和飞燕草素-3-顺式香芸豆素-葡萄糖苷［4］。研究发现，花青素的生物合成开始于苯丙酸途径，随后是类黄酮途径，共有12 类结构基因和3 类转录调控基因参与了该途径［5，6］。人们利用花青素强抗氧化性的特性，广泛用于药品和保健品的加工生产，充分发挥其抗癌、消炎、降血脂、延缓衰老等作用［7］。花青素的提取方法主要有有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法、水溶液提取法、酶提取法、发酵提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、高压脉冲电场辅助提取法、液态静高压法辅助提取法［8，9］。花青素的 分 析方法主 要 有单pH 法、pH示差法、紫外分光光度法、液相色谱法等。单pH法和紫外分光光度法难以排除其他杂质对花青素含量测定的影响，而液相色谱法费用较高，pH 示差法可以快速准确的确定花青素的含量［10］。

本研究采用响应面试验法优化紫色观赏辣椒花青素的提取条件，筛选出最佳提取工艺和测定条件，比较获得花青素含量较高的观赏辣椒品种，明确果实色泽与花青素含量的相关性，为花青素的测定、高水平花青素积累的观赏辣椒品种选育以及观赏辣椒评价体系的建立提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以紫色观赏辣椒品种M3、Q1、Q6 坐果期的果实为试材，进行花青素的提取工艺优化以及pH 示差法测定条件的确定，并利用该优化条件分析比较不同观赏辣椒品种M3、M3’、Q1、Q2、Q3、Q4-2、Q4-3、Q6、W1、W8、WU 绿熟期果实的花青素含量。在坐果期和绿熟期采摘果实后，去除胎座和果梗部分，混合均匀保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 花青素的提取及定量分析

称取0.5 g 不同品种紫色观赏辣椒果皮，置于10 mL 浸提液中，超声浸提30 min 后果皮呈无色，离心处理10 min，上清液为花青素待测液，用于花青素含量测定。

吸取2 mL 上清液，分别加入不同pH 的缓冲液定容至10 mL，在最适宜平衡温度和平衡时间处理下，以蒸馏水作为空白对照，测定吸光度，根据公式计算观赏辣椒果皮中花青素含量［10］。

M：矢车菊素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2 g·moL-1；

DF：稀释因子；

V：提取液总体积，mL；

m：重量，g；

ε：矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900 L·mol-1·cm-1；

L：光程，1 cm。

1.2.2 紫色观赏辣椒花青素提取体系的优化

（1）最大吸收波长的确定

以蒸馏水为对照，使用紫外分光光度计对花青素待测液在480～620 nm 范围内进行光谱扫描，确定观赏辣椒花青素的最大吸收波长。

（2）单因素试验

称取0.5 g 不同品种紫色观赏辣椒果皮，置于10 mL 蒸 馏 水、丙 酮、1%HCl 甲 醇、1%HCl 乙 醇中，采用超声波辅助法浸提，测定花青素最大吸收波长下的吸光值，筛选最佳提取试剂。

设计单因素试验，以Q6 为试材，分析比较不同提取剂浓度、料液比、超声时间对花青素的提取效果，根据试验结果确定单因素的最佳条件。每个因素设置5 个水平，提取剂浓度为100%、90%、80%、70%、60%；料液比为1∶10 g·mL-1、1∶15 g·mL-1、1∶25 g·mL-1、1∶30 g·mL-1、1∶35 g·mL-1；超声时间为10、20、30、40、50 min。

（3）响应面试验

采用统计设计软件Design Expert 8.0.5，综合单因素试验测定结果确定响应面水平（表1），并设计响应面试验，以3 个主要因素提取剂浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）为自变量，以花青素得率为响应值，以获得最佳提取工艺条件。

表1 响应面中心组合设计试验因素与水平编码表Table 1 Factors and level codes for the center combination design test

1.2.3 紫色观赏辣椒花青素测定条件的确定

（1）最佳pH 的确定

吸取2 mL 上清液，分别加入pH 为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 的缓冲液定容至10 mL，测定最大吸收波长下不同酸度缓冲液的吸光值，确定吸光值差异最大的2 个pH。

（2）最佳平衡时间的确定

将加入缓冲液的待测液，放入40 ℃的水浴锅中分别平衡50、70、90、110、130 min 后定量分析比较不同品种的花青素含量，确定最佳平衡时间。

（3）最佳平衡温度的确定

将加入缓冲液的待测液，分别放入20、30、40、50 ℃的平衡温度下水浴，分析比较花青素含量，确定最佳平衡温度。

1.2.4 回收试验

采用2.2.1 的方法提取M3 和Q1 果皮中的花青素，离心后去除残渣，将M3 的待测液稀释一倍后，分2 份使用旋转蒸发仪浓缩干燥，其中一份加入5 mL 提取试剂溶解后作为标样，一份加入5 mL Q1 待测液作为试样加标样，Q1 提取液作为试样直接使用pH 示差法测定花青素含量，并计算分析回收试验相对标准偏差（RSD%）和试验加标回收率。

1.2.5 重复性考察

利用该试验确定的条件测定M3 的花青素含量，重复测定7 次，计算RSD%。

1.2.6 不同品种观赏辣椒花青素含量的测定

利用筛选出的优化条件测定不同品种观赏辣椒果实的花青素含量。

1.2.7 观赏辣椒果实色差值的测定

使用CM-700D 色差仪（柯尼卡美能达，日本）测定不同品种观赏辣椒果实的色差值。

1.3 数据的整理与分析

使用Excel 和GraphPad Prism 8.0.5 进行数据的整理与分析，使用GraphPad Prism 8.0.5 进行作图。

2 结果与分析

2.1 紫色观赏辣椒花青素提取体系的优化

2.1.1 最大吸收波长的确定

将用1%HCl 甲醇提取的花青素待测液进行光谱扫描，在480～620 nm 范围内待测液光谱吸收值呈先上升后下降的趋势，且在530 nm 处达到峰值，由此可得：紫色观赏辣椒果实中花青素的最大吸收波长在530 nm。

2.1.2 最佳提取试剂的确定

通过对待测液在530 nm 处的吸光值测定，不同提取试剂的提取效果如图1 所示：不同品种皆表现为1%HCl 甲醇提取效果最佳，其次为1%HCl乙醇、水，丙酮的提取效果最差。

2.1.3 不同提取剂浓度对花青素提取效果的影响

由2.1.2 试验结果可知1%HCl 甲醇的提取效果最佳，故在提取剂浓度单因素试验中，以不同浓度1%HCl 甲醇为提取剂，料液比1∶20 g·mL-1，超声时间为30 min 进行试验，花青素提取量如图2 所示，可见不同浓度的1%HCl 甲醇提取剂提取效果存在显著差异，当提取剂浓度为100%和90%时提取效果较好，且提取效果依次为100%＞90%＞60%＞80%＞70%。

图1 不同提取试剂的提取效果Fig.1 Extraction capacity of different extraction reagents

图2 不同提取剂浓度对花青素提取量的影响Fig.2 Effect of different extractant concentrations on anthocyanin extraction

2.1.4 不同料液比对花青素提取效果的影响

在料液比单因素试验中，以100%甲醇（1%HCl）为提取剂，超声提取30 min。试验结果表明：随着提取剂比例的增加，花青素的提取量呈先增加后下降的趋势，且在料液比为1∶25 g·mL-1时到达峰值，继续增大料液比，花青素含量则降低（图3）。因此，在料液比单因素试验中，料液比为1∶25时花青素的提取量最高，提取效果最佳。

2.1.5 不同提取时间对花青素提取效果的影响

以100%甲醇（1%HCl）为提取试剂，料液比为1∶20 g·mL-1，比较不同提取时间花青素的提取量（图4）。随着提取时间的增加，花青素逐渐析出，在40 min 后花青素含量趋于稳定，此时花青素全部析出，且组织泛白。

2.1.6 响应面试验

根据单因素试验结果，确定响应面试验各因素的3 个水平（表1），利用Design Expert 8.0.5 软件设计响应面试验，设计方案和结果如表2 所示，对表2 试验结果进行多元拟合分析，得出以花青素得率为响应值的回归方程：

图3 不同料液比对花青素提取量的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on anthocyanin extraction

图4 不同提取时间比对花青素提取量的影响Fig.4 Effect of extration time on anthocyanin extraction

表2 响应面设计方案及结果Table 2 Response surface plan and results

方差分析结果见表3，由ANVOA 分析可知：模型P=0.000 9＜0.001（极显著），失拟项P=0.725 4＞0.05（不显著），决定系数R2=0.949 8，表明回归方程显著，失拟项不显著，响应面回归方程的拟合度良好。从各因素的显著性水平分析可知，对紫色观赏辣椒中花青素得率的影响分别为：料液比（B）＞提取时间（C）＞甲醇浓度（A），且3 个因素对花青素得率的影响都达显著水平（P＜0.05）；甲醇浓度、料液比、提取时间的二次项A2、B2、C2对花青素得率有极显著（P＜0.01）的影响；各因素之间的交互项AB、BC、AC 影响不显著。

根据上述方程得出的响应面及等高线结果见图5～图7。图5 表示甲醇浓度和料液比的交互作用对花青素得率的影响，当甲醇浓度为95%～100%，料液比为1∶22～1∶26 g·mL-1时，花青素含量较高，且能达到最大值。当甲醇浓度为95%～100%，提取时间在35～45 min 范围内时，花青素含量较高（图6）。图7 可看出料液比与提取时间对花青素得率的影响，在料液比为1∶22～1∶26 g·mL-1，提取时间为35～45 min 时可提高花青素的提取率。

表3 响应面回归分析模型ANOVA 分析结果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

图5 甲醇浓度（A）和料液比（B）对花青素含量影响的响应面分析Fig.5 Response surface analysis of the effects of methanol concentration and solid-liquid ratio on anthocyanin content

最终通过软件Design-expert 8.0.5 软件分析得出紫色观赏辣椒花青素的最佳提取条件：当甲醇浓度为90%，料液比1∶25 g·mL-1，提取时间为40 min 时，花青素提取工艺较佳，预测值为10.06 mg·100g-1。以所得最佳提取条件进行3 次平行试验，所得花青素含量平均值为10.15 mg·100g-1，与预测值相近，说明该条件下预测值与实际值拟合度良好，可靠性较高。

2.2 紫色观赏辣椒中花青素测定条件的确定

2.2.1 最佳pH 的确定

在不同pH 缓冲液处理下，品种Q1、Q6 和M3的花青素吸光值随着缓冲液酸度的减弱，整体呈先上升后下降的趋势，所有紫色观赏辣椒品种皆在pH 为1.0 时达峰值，在pH 为4.5 后趋于平缓或略微上升（图8）。综上所述，最佳的缓冲液pH 分别为1.0 和4.5。

图6 甲醇浓度（A）和提取时间（C）对花青素含量影响的响应面分析Fig.6 Response surface analysis of the effects of methanol concentration and extraction time on anthocyanin content

图7 料液比（B）和提取时间（C）对花青素含量影响的响应面分析Fig.7 Response surface analysis of the effects of solid-liquid ratio and extraction time on anthocyanin content

图8 不同pH 缓冲液处理下花青素的吸收值Fig.8 OD values of anthocyanin under different pH

2.2.2 最佳平衡时间和平衡温度的确定

在平衡温度为40 ℃时，随着平衡时间的延长，所有测定品种的花青素测定量逐渐增加，趋于稳定，且在90 min 达到最大。在不同温度处理下，花青素含量皆在40℃达到最大（图9）。因此，在平衡温度为40 ℃，平衡时间为90 min 时，花青素含量的测定值最稳定。

2.3 回收试验

为验证筛选的最佳测定条件，即提取试剂为1%HCl 甲醇，料液比为1∶20，最大吸收波长为530 nm，pH 为1.0 和4.5，40℃平衡90 min，测定紫色观赏辣椒果实中花青素含量，进行加标回收试验，测定加标回收率，在该提取条件下回收率波动范围不大，回收率平均值达0.992 3，且相对标准偏差较小，为0.89%。

2.4 重复性考察

对M3 的花青素含量重复测定7 次，看出ΔA值和花青素含量波动范围较小，花青素含量在（12.298 0±0.16）mg·100g-1，RSD%为1.33%，在该工艺条件下，可以很好的排除其它杂质对花青素含量测定的影响。

2.5 不同品种观赏辣椒果色分析

利用色差仪测定样品的L*（明亮度）、a*（红绿色度）、b*（黄蓝色度）参数。由图10、图11 可见，不同品种的紫色观赏辣椒L*参数皆为正数，且品种W1 和W8 的L*最大，其果色亮度最高；Q4-3 的a*为负值，其它品种的a*皆为正值，且Q1、Q2、Q4-2、Q6 的a*较小；品种M3、Q1、Q2、Q4-2、WU 的b*为负值。

图9 不同平衡时间、温度对花青素含量的影响Fig.9 Effect of different balance time and temperature on anthocyanin content

2.6 不同品种紫色观赏辣椒的花青素含量比较

不同品种观赏辣椒的花青素含量存在明显差异（图12），品种Q2 的花青素含量最高，Q1、Q4-3、WU 之间花青素含量无显著差异，且显著高于其他品种，品种M3’、Q4-3、W1、W8 的花青素含量较低，M3’含量最低且显著性低于其它品种。

图10 不同品种观赏辣椒果色Fig.10 Fruit color of different cultivar of ornamental pepper

2.7 紫色观赏辣椒果色与花青素含量相关性分析

果色与花青素含量的相关性如表4 所示，花青素含量与色差参数都表现为负相关，且与L*、b*强相关，与a*基本无相关；L*与a*、b*都正相关，与b*为强相关（0.765 0），a*与b*之间呈弱的负相关。

3 讨论

花青素是一类天然的色素物质，是植物体花朵、果实、叶片的着色剂，同时也有很强的药用价值，被广泛地用于医疗保健业。花青素的强吸收在紫外区域与可见光区域皆存在，其中紫外区的强吸收出现在280 nm 附近，可见光区域最大吸收波长在500～550 nm 范围内，且吸收峰位置会受溶剂、花色苷母核、糖基数目和位置等因素影响［11］。本研究中在530 nm 处存在典型吸收峰，与紫薯一致，其花青素在530 nm 处出现一个宽的吸收峰，这是花青素在酸性环境中的典型特征峰［12］，而山桃稠李果实在517 nm 处有明显的花青素特征吸收峰［13］，红菊苣花青素吸收峰在520 nm［14］，黑小麦粉中花青素的最大吸收波长在531 nm［15］。

本研究采用单因素试验和响应面法来确定紫色观赏辣椒中花青素的最佳提取工艺，先通过单因素试验确定了花青素提取的最佳提取剂，料液比以及超声时间，但单因素试验仅仅可以确定每个因素的最佳水平，各因素之间往往存在交互作用，并不是单因素的最佳水平组合就能得到最好的提取条件。响应面分析法通过合理的试验设计，利用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，分析回归方程以筛选最佳的工艺条件［16］。利用响应面分析法将通过单因素试验确定的各因素较佳的水平进行随机组合，可分析确定各因素之间的交互作用，从而筛选出最佳的组合，它与传统的正交试验相比，节省了大量的时间以及财力，同时也提高了提取方法的精密度和准确度。响应面法被广泛应用于食品加工业，多用于营养成分的提取工艺优化中，当前已应用于黄酮［17］、多酚［18］、果胶［19］等物质。在单因素试验中，得到含1% HCl 的甲醇和乙醇对花青素的提取效果较佳，含1% HCl 的甲醇的提取效果最好，同朱安娜等人研究结果一致，在紫薯花青素提取剂筛选研究中，酸性甲醇和酸性乙醇的提取效果最佳［12］。李文鹏等人通过分析比较不同浓度的乙醇、丙酮、水对花青素的提取能力，发现40 %丙酮的提取效果最佳，而本研究中丙酮的提取效果较差，可能是因为使用的提取试剂为纯丙酮，氢键缔合反应常产生于纯丙酮中的羧基与花青素分子之间，纯丙酮对花青素的溶解度较小，纯丙酮极性低，通过加入极性较大的水后可以调节其极性，从而提高花青素的提取率［20］。花青素含量随着料液比的增加存在一个先增加后降低的趋势，是因为在提取液体积过少时，溶液提取达到饱和，溶液浓度高导致了提取效率的降低，料液比过大时，不仅使得溶液稀释，还会消耗过多的提取试剂。随着提取时间的延长，花青素含量逐渐稳定，有效成分的析出达到稳定。前人指出随着提取时间的增加，提取率呈先增加后下降的趋势，但下降幅度不大，原因是在一定时间范围内，物质的溶出率会随着时间的增加而提高，到达某时间后，溶液体系的渗透压达到平衡时溶出率的变化不大［21］。响应面试验法可分析确定各因素之间的交互作用，从而设计出最佳的水平组合，响应面的3D 图和等高线图可以明显表示多个自变量以及自变量之间的交互作用对花青素得率的影响，在3D 图中，自变量的影响力随着响应面的陡峭程度而增大，同时在控制其它因素不变的情况下可以分析比较2 个有交互作用的因素对花青素含量的影响［22］。在玫瑰茄花青素提取工艺研究中，石艳宾等人提出提取时间与提取剂浓度，料液比与提取剂浓度交互作用不显著，与本研究结果一致，认为交互项甲醇浓度与料液比AB、甲醇浓度与提取试时间AC、料液比与提取时间BC 对花青素含量的影响并不显著［23］。结合响应面对交互作用的分析结果，设计了最佳的观赏辣椒花青素提取工艺为甲醇浓度90%，料液比1∶25 g·mL-1，提取时间40 min。

图11 不同品种观赏辣椒果实色差值Fig.11 Chromaticity values of different cultivar of ornamental pepper

图12 不同品种紫色观赏辣椒绿熟期果实花青素含量Fig.12 Anthocyanin content in fruits of different cultivar of purple ornamental pepper at green maturity

表4 果色与花青素色素含量相关性分析Table 4 Correlation analysis between fruit color and anthocyanin pigment content

当前花青素含量的测定方法有很多，姚华开利用紫外分光光度计法建立了紫色蔬菜的花青素含量的测定体系，该方法耗时短，成本廉价，但是相比于其它方法，精确度不高，且很难排除其他色素杂质对花青素含量测定的影响［24］；高效液相色谱法主要是对具体的花青素成分进行测定，精确度较高，但是成本昂贵，试验耗时耗力，相比于其它方法，pH 示差法能够精确快速的得出植物中的花青素含量，同时也可以排除叶绿素等其他色素物质对测定结果的影响。花青素颜色很容易受到一些因素的影响，如温度、pH 值、溶剂、光照、颜料本身的结构和其它分子的存在［25，26］。花青素由2-苯基苯并吡喃环和环上不同的取代基组成，在不同的pH 下，可形成不同的结构，这些结构分别为醌式碱（蓝色）、花烊正离子（红色）、甲醇假碱和查尔酮（无色），在一个特定的pH 条件下，这些结构会达到一定的平衡，在强酸条件下，花青素溶液会表现为红色，随着pH 的增加，颜色逐渐变淡，在中性条件下，溶液会表现为无色，而碱性条件下，则会呈蓝色［27，28］。pH 示差法根据花青素结构转换的函数，来确定花青素吸光度差别最大但稳定的2 个pH［29］。在本研究中相差最大的2 个pH 分别为1.0和4.5，观赏辣椒花青素在pH 为1.0 时，吸光度达到最大，随着pH 的增加，吸光度逐渐降低，在pH为4.5 后吸光值稳定，同该结果一致，在黑小麦全麦粉［15］、红菊苣［14］、紫色马铃薯［12］、蓝莓［30］等植物花青素含量测定中，最佳的缓冲液pH 皆为1和4.5。

紫色观赏辣椒果实颜色的深浅与花青素含量存在明显的负相关性，这与刘艺等［31］的研究结果一致，认为蓝莓果实的花青素含量与L*显著负相关。且研究发现花青素含量与b*值的相关性高于a*值，这与Singha 等［32］的结果一致，他指出苹果中花青素含量与B 值的相关性高于A 值。在生产生活中，可以利用这一特性来快速预测其花青素含量，果实色泽越深，花青素积累水平越高，可以为观赏辣椒评价体系的建立提供一定的理论依据。

4 结论

本研究以紫色观赏辣椒为试材，利用单因素试验法筛选各因素的最佳水平，响应面试验设计提取方案，明确各因素之间的交互作用，确定其果实中花青素的提取工艺为：以90%甲醇（1%HCl）为提取剂，料液比为1∶25，超声辅助提取40 min。通过分析比较不同缓冲液pH、平衡时间以及平衡温度对花青素含量测定的影响，优化pH 示差法测定条件，加标回收试验和稳定性考察来验证该优化体系，结果表明缓冲液pH 为1.0 和4.5，40 ℃平衡90 min 为最佳的测定条件。利用该优化条件测定了不同品种观赏辣椒果实花青素含量，并与果实色差值进行关联分析，明确了果实色差值L*、b*与花青素含量呈负的强相关，筛选出花青素积累水平较高的品种为Q1、Q2、Q4-3、WU，进一步验证了该优化条件的可行性。本研究结果为观赏辣椒花青素含量的测定以及评价体系的建立提供实践依据，并为高水平花青素积累的品种选育奠定基础。