柳膜肩网蝽和悬铃方翅目网蝽体内微生物多样性研究（半翅目：网蝽科）

李荣荣，李敏，刘丽洁，徐喆，张虎芳

（1.太原师范学院，山西 晋中030619；2.陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安71011；3.忻州师范学院，山西 忻州034000）

昆虫是世界上种类最为繁多的动物类群［1］，在昆虫体内通常存在多种微生物，在与宿主持久共同的进化过程当中构成了相互依存、不可分割的共生关系［2，3］。这些微生物可以定植在昆虫的肠道、血淋巴、生殖系统等组织结构中，在宿主营养物质的摄取、有害物质的代谢等诸多生理功能中发挥重要的作用，进而影响宿主的生长、发育、繁殖和免疫等［1，4］。近年来关于昆虫微生物的研究越来越多，而利用高通量测序技术对昆虫微生物多样性的研究则是一个热门领域，涉及到的昆虫种类非常广泛如鳞翅目、膜翅目、蜚蠊目、鞘翅目、直翅目等［5～9］。对于半翅目的蝽类昆虫来说，国内外对于共生菌的研究多集中于肠道优势菌的种类、亲子代间的传播方式及其与寄主的共同进化关系等方面，使用的方法还主要依赖于传统的微生物分离培养及基于16S rRNA 基因的PCR-DGGE 技术，使用高通量测序实现昆虫微生物组成和多样性的研究相对 较少［10～12］。

柳膜肩网蝽（Hegesidemus habrusDrake）与悬铃木方翅网蝽（Corythucha ciliateSay）均隶属于半翅目Hemiptera，异翅亚目Heteroptera，网蝽科Tingidae。二者都是刺吸式口器，其中柳膜肩网蝽以吸取杨树、柳树等植物叶片的汁液为食，近几年在山西省晋中市危害严重［13］。悬铃木方翅网蝽以刺吸悬铃木属植物叶片汁液为食，是一种重要的林业危险性入侵害虫［14］。两者均可通过吸食叶片汁液，导致叶片组织失水，使叶片表面产生成片的白色斑点，叶片背面则有许多深褐色黏液排泄物，严重影响寄生植物叶片的光合作用和呼吸作用［15～17］。我国对柳膜肩网蝽的研究很少，主要集中于柳膜肩网蝽的防治方面［13，15］；对悬铃木方翅网蝽的研究主要集中于分类、入侵机理、生物学特性及防治［14，16～19］，两者体内微生物组成及功能方面还未有报道。

本试验以柳膜肩网蝽与悬铃木方翅网蝽成虫为研究对象，通过16S rRNA 高通量测序技术揭示柳膜肩网蝽和悬铃木方翅网蝽体内细菌组成及多样性，旨在为其它蝽类昆虫肠道微生物多样性分析提供数据支持，也希望能为二者的防治提供一些理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

2018 年9 月分别于山西省晋中市榆次区龙湖街旁垂柳（Salix babylonica）及一球悬铃木（Platanus occidentalis）上采集柳膜肩网蝽JH 和悬铃木方翅网蝽JC 样本；悬铃木方翅网蝽LC 样本于2018年10 月采自于临汾市洪洞县108 国道旁一球悬铃木。

1.2 试虫处理

取柳膜肩网蝽与不同地理位点的悬铃木方翅网蝽成虫各30 头，饥饿处理6 h，随后在超净工作台采取75%的酒精对虫体表面消毒3 次，每次3 min，再用无菌水清洗5 遍。将2 种成虫各分为3组，每组10 头，分别装入2 mL 已灭菌的离心管中，置于-70 ℃冰箱中备用。按照Mag-bind soil DNA提取试剂盒（Omega，Norcross，GA，美国）说明书分别提取处理后的柳膜肩网蝽和悬铃木方翅网蝽总DNA。使用NanoDropND-1000（Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国）红外线分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分别检测DNA 浓度和质量。

1.3 16S rRNA 基因的PCR 扩增和高通量测序

使用通用引物 338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）及 806R（5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′）对 细 菌16S 的V3-V4 区进行扩增［20］。扩增体系共25 μL，包括：5×reaction buffer 5 μL，5×GC buffer 5 μL，dNTP（2.5 mM）2 μL，引物338F/806R（10 μM）各1 μL，DNA 模板3 μL，Q5 DNA 聚合酶0.25 μL，ddH2O 7.75 μL。PCR 扩增条件：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环25次之后72 ℃延伸5 min。PCR 产物经过2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrep（Axygen，Silicon Valley，美国）凝胶抽提试剂盒将目标片段回收。纯化后的合格PCR 产物送往上海派森诺生物科技有限公司，采用Illumina MiSeq 测序平台进行双端测序。

1.4 数据统计与分析

MiSeq 测序完成后，应用QIIME v1.8.0 软件处理下机数据［21］。首先对测序数据进行质量筛查，去除包括碱基平均质量＜Q20，序列长度＜100 bp，包含模糊碱基及单核苷酸重复＞8 bp的低质量序列。使用Flash v1.2.11［22］软件对通过初筛的序列进行配对拼接，随后调用USEARCH v5.2.236 检查并剔除嵌合体序列，最后得到高质量 序 列。在QIIME 软 件中调用UCLUST［23］对有效序列按97% 的序列相似度进行聚类并进行OTU（Operational Taxonomic Unit，可操作分类单元）划分。使用best hit［24］依 据Greengenes 数 据库［25］对扩增所得的细菌16S rRNA 进行物种注释。去除丰度低于全体样本测序总量十万分之一（0.001%）的OTU［26］得到稀有OTU 矩阵。使用QIIME 软件绘制稀疏曲线（Rarefaction curve），计算可以反映样品群落丰度的Chao1 和ACE 指数，以及反映样品中物种多样性的Shannon 和Simpson 指数。使用美吉云平台（https：//cloud.majorbio.com/）和Heml v1.0［27］分别进行组间差异分析和热图分析。

2 结果与分析

2.1 测序数据和聚类分析

本研究所选用的9 个样品共测得396 393 条原始序列，长度分布在152～469 bp 范围内，最多的序列长度为430 bp（150 222 条），所测得序列平均长度421 bp。

柳膜肩网蝽16S rRNA 高通量测序最终获得原始序列162 691 条，质控后的有效序列147 376条（表1）。JH1、JH2 和JH3 样本对应的有效序列分别为49 124、43 280 和54 972 条。去除掉丰度值低于全体样本测序总量0.001%的OTU 后，分别得到1 015、1 050、1 250 条OTU 序列。

悬铃木方翅网蝽高通量测序获得原始序列233 702 条，有效序列218 771 条（表1）。JC1、JC2和JC3 样品对应的有效序列分别为38 023、36 138、36 299，LC1、LC2 和LC3 样品对应的有效序列分别为37 657、35 388、35 266。去除掉丰度值低于全体样本测序总量0.001%的OUT 后，分别得到583、604、753、620、581、482 个OTU 序列。

表1 细菌16S rRNA 基因高通量测序概况Table 1 Summary of 16S rRNA gene high-throughput sequencing data

2.2 Alpha 多样性分析

所有9 个样品的稀疏曲线显示在97%相似性水平下（图1），16S rRNA 高通量测序的稀疏曲线逐渐趋于平坦，这说明每个样本的测序量充足，测序深度可以基本覆盖样本中全部微生物种类。Chao1和ACE 指数显示，柳膜肩网蝽样品群落丰富度明显高于悬铃木方翅网蝽（JH vs JC，P=0.02；JH vs LC，P=0.01）。柳膜肩网蝽的3 个样本中JH3 样本群落丰富度最高，悬铃木方翅网蝽JC 的3 个样本中JC3 样本群落丰富度最高，LC 样本中LC1 群落丰富度最高。Shannon 和Simpson 指数显示：柳膜肩网蝽和悬铃木样本微生物物种多样性无显著差异（P＞0.05）。柳膜肩网蝽的3 个样本中JH2 样本群落多样性最高，悬铃木方翅网蝽JC 的3 个样本中JC1 样本群落多样性最高，LC 样本中LC1 群落多样性最高（表2）。

图1 OTU 数的稀疏曲线图Fig.1 Rarefaction curve of OTUs

2.3 柳膜肩网蝽与悬铃木方翅网蝽微生物组成及其丰度分析

在门分类阶元水平，柳膜肩网蝽和悬铃木方翅网蝽的各组样品都拥有变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、栖热菌门（Thermi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）和蓝藻门（Cyanobacteria）（图2A）。柳膜肩网蝽3 组样品均以变形菌门（39.26%）、厚壁菌门（36.48%）和栖热菌门（8.30%）为优势菌，3 者共占到总数的80%以上。悬铃木方翅网蝽样本的优势菌包括变形菌门（39.60%）、栖热菌门（43.7%）、拟杆菌门（24.67%）和厚壁菌门（Firmicutes）（10.00%），共占总数的90%以上。PCA 分析显示，沿PC2 轴可以将柳膜肩网蝽样品和悬铃木方尺网蝽样品明显区分，说明二者的群落结构有明显差异（图2B）。悬铃木方翅网蝽JC 和LC 样本相比较，LC 样本的变形菌门显著增加，蓝藻门则显著减少。两者的丰度在JC 和LC 样本间存在显著的差异（Welch′s t-test，变形菌门P=0.03，蓝藻门P=0.02）。

去除掉丰度小于1%的OTU 后，柳膜肩网蝽和悬铃木方翅网蝽样本共找到9 个核心属（表3）。其中厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、栖热菌属（Thermus）、沃尔巴克氏体（Wolbachia）在柳膜肩网蝽样品中丰度较高（图3）。而厌氧芽孢杆菌属、“CandidatusCardinium”、乳球菌属（Lactococcus）、苍白杆菌属、沙雷氏菌属（Serratia）及栖热菌属在悬铃木方翅网蝽样品中含量较高（图3）。悬铃木方尺网蝽核心属在JC 样本和LC 样本间不存在显著差异（Welch′s t-test，P＞0.05）。

表2 细菌多样性指数统计Table 2 Diversity indices of bacteria

图2 柳膜肩网蝽与悬铃木方翅网蝽微生物组成分析Fig.2 Community structure analysis of Hegesidemus habrus and Corythucha ciliate

3 讨论与结论

昆虫体内栖居着种类繁多的微生物，它们影响着昆虫的营养、防御、生殖等方面，在昆虫生态和进化过程中起着非常重要的作用［4，28］。与所有的昆虫一样，蝽类昆虫体内也栖居着多种多样的微生物［2］。基于16S rRNA 高通量测序技术的研究结果表明，柳膜肩网蝽和悬铃木方翅网蝽体内微生物种类丰富多样，二者在门水平的种类组成相似（都包括变形菌门、厚壁菌门、栖热菌门、拟杆菌门、放线菌门及蓝藻门），但丰度差异较大，PCA 分析可以明显将两者区分开，这说明网蝽科昆虫体内微生物组成具有一定的特异性。悬铃木方翅网蝽JC 样本和LC样本在门水平存在显著丰度差异，但核心属不存在显著差异，这说明同一物种不同地理种群间核心属的种类和丰度相对稳定。

在属级水平两者间的优势菌有明显区别，厌氧芽孢杆菌属、苍白杆菌属、栖热菌属、沃尔巴克氏体在柳膜肩网蝽样品中丰度较高（图3）。而厌氧芽孢杆菌属、“CandidatusCardinium”、乳球菌属、苍白杆菌属、沙雷氏菌属（Serratia）及栖热菌属在悬铃木方翅网蝽样品中含量较高。通过对比发现栖热菌属是二者体内共同的优势菌，其在所有的9 个样本中丰度值均超过2%，在JC2 样本中最高（51.37%）。早期基于细菌16S rRNA 基因全长测序的研究表明不同蝽类昆虫的体内栖居的共生菌并不相同，如龟蝽科、同蝽科、异蝽科和蝽科昆虫多与γ-变形杆菌（γ-Proteobacteria）共生；而缘蝽科、长蝽科昆虫多与β - 变形杆菌中的伯克氏菌（Burkholderia）共生［29～31］。柳膜肩网蝽和悬铃木方翅网蝽同属半翅目异翅亚目网蝽科，二者体内均共栖着大量栖热菌属（Thermus）微生物，这或许表明栖热菌属可能是网蝽科昆虫体内普遍存在的共生菌。但目前为止，网蝽科昆虫微生物多样性的研究还未见报道，这一结论还需更多实验数据的支持。

图3 悬铃木方翅网蝽和柳膜肩网蝽核心属相对丰度热图Fig.3 Relative abundance of the core genera in Hegesidemus habrus and Corythucha ciliate

表3 相对丰度＞1%的核心OUT 和其对应的属级分类Table 3 Bacteria taxonomy and relative abundance of bacterial OTUs higher than 1%

沃尔巴克氏体（Wolbachia）属于α-Proteobacteria，是一种常见的昆虫细胞内共生革兰氏阴性菌，可在鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目等10多个目的昆虫体内共生［32］。沃尔巴克氏体主要存在于昆虫的生殖组织细胞中，比如精巢和卵巢，尤其在卵细胞中的丰度最高［33］。在长期的进化过程中，沃尔巴克氏体形成了可以通过诱导胞质不亲和、孤雌生殖、杀雄等机制来对宿主的生殖实现调控作用，除此之外，它还可以帮助宿主增强抗性、调控宿主的其它生命活动并影响其物种形成和进化［34，35］。正因如此，沃尔巴克氏体已被探究应用于白蚊、伊蚊等媒介昆虫的种群数量控制，从而实现虫媒病的控制［36，37］。在一些农业害虫如蚜虫、果蝇等都也都检测出很高的沃尔巴克氏体感染率，而且不同地理种群间其株系间的差异较大。本研究中，沃尔巴克氏体在柳膜肩网蝽体内丰度较高，说明自然状态下柳膜肩网蝽感染率较高。而悬铃木方翅网蝽样本中仅LC1 样本检测出沃尔巴克氏体感染，这说明自然状态下悬铃木方翅网蝽可以感染沃尔巴克氏体，但感染率并不高。

虽然如此，我们在悬铃木方翅网蝽样本中发现了另外一种重要的次级内共生菌“CandidatusCardinium hertigii”，简称“Cardinium”。Cardinium在昆虫体内分布没有沃尔巴克氏体那么广泛，首次被发现是在寄生蜂体内，可以引起寄主雌性化、诱导孤雌生殖、胞质不亲和等［38，39］。此外，它还可以引起螨类的生殖异常、降低烟粉虱的适合度并影响其取食 行 为［40，41］。本 研 究 中 无 论 是JC 样 本 还 是LC 样本，都具有较高的Cardinium感染率。目前关于柳膜肩网蝽和悬铃木方翅网蝽的防治大多以化学防治手段为主。Wolbachia和Cardinium的发现或许可以给柳膜肩网蝽和悬铃木方翅网蝽的防治提供新思路。

综上所述，本研究首次使用16S rRNA 高通量测序技术对网蝽科昆虫体内微生物进行研究。研究发现2 种网蝽体内微生物组成差异明显，但也有一些共有的核心菌群。沃尔巴克氏体和Cardinium分别在柳膜肩网蝽与悬铃木方翅网蝽样本中发现，它们与宿主的进化关系如何，是否能对宿主生殖进行调控都值得进一步研究。