植物代谢法富集粮食中γ－氨基丁酸的研究进展

姜秀杰 ，许庆鹏 ，张爱武 ，曹冬梅 ，张东杰 ，

（1.黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心，大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学食品学院）

γ-氨基丁酸又称氨酪酸或4-氨基丁酸，简称GABA，是一种四碳非蛋白氨基酸，以自由态形式广泛存在于自然界中[1]。GABA 最早于1910 年在腐生菌中检测到[2]。在随后的100 年中，研究者相继在不同动物神经组织，豆科、中草药种子、根茎和组织液等植物中检测到。GABA 分子量为103.1，分子式为C4H9NO2，易溶于水、微溶于乙醇、不容于乙醚，在生理pH 条件下为两性分子[3]。在植物体内，GABA 起到平衡碳源、氮源及传递信号作用，保证植物的正常生长。GABA 在人体内，主要分布在神经组织中，通过调控人体中枢神经系统，达到降血压作用，且降血压机理已得到动物实验及临床医学的证实[4]。在外周器官中，GABA 可作用于胰岛A、B 细胞，通过诱导细胞膜超极化及去极化，实现平衡血糖作用[5-6]。还可降低神经元活性、调节心律失常、缓解失眠及疲劳等生理功能。然而植物原料中GABA 含量很低，通常在0.3～32.5 μmol·g-1之间[7]，欲利用植物中 GABA 加工成功能食品，则需对GABA 进行高效富集。

近年来，随着供给侧结构改革方案的提出，农业种植结构处于调整及转变阶段，多元化、产业化的种植结构应运而生，促使粮食生产数量及质量不断提升，但农业生产效益并没有出现大幅度提高，甚至部分作物出现丰产却滞销的情况，给农民收入造成巨大损失。产业竞争加剧，特色产业、功能食品开发面临重大挑战。2009 年我国卫生部将GABA 纳入新资源行列，批准用于食品生产及加工[8]。因此，以粮食为原料富集GABA，开发高附加值的功能产品，对延伸农业种植产业链，增加农业经济效益意义重大。

目前，以粮食为原料产出的GABA 产品因其安全、天然性备受欢迎，已成为食品领域研究热点。首先粮食原料丰富且价格低廉，其次谷物及豆类种子经发芽处理[9]、盐胁迫[10]、热激[11]、机械损伤[12]、低氧[13]等逆境胁迫或植物激素作用时会使GABA 提高数倍甚至数十倍，同时发芽富集能够调整种子的营养成分，降低抗营养因子，提高营养价值。市售富含GABA 的粮食类产品，主要有日本的发芽玄米及饮料、麦茶；中国的发芽糙米、豆乳、米乳苦荞茶等系列食品[14]。其中植物代谢法富集GABA 相关报道较多，为此，对粮食中GABA 代谢机理及富集工艺进行梳理，为富含GABA 产品的深度开发提供参考。

1 粮食中γ-氨基丁酸支路代谢途径

高等植物有两条GABA 合成及转换途径，一种是L-谷氨酸（L-Glu）脱羧而成，以谷氨酸为底物，经L-谷氨酸脱羧酶催化形成GABA，该途径被称为GABA 旁路或支路[15-16]；另一种是多胺降解途径，由二胺或多胺（PAs）分别经二胺氧化酶（DAO）和多胺氧化酶（PAO）催化产生4-氨基丁醛，再经4-氨基丁醛脱氢酶（AMADH）脱氢生成GABA 的过程，多胺降解途径最终与 GABA 支路交汇后参与 TCA 循环代谢[4，17]。

GABA 支路代谢广泛分布于动物、植物、真菌和细菌中，是GABA 积累及转化的重要途径，禾谷类粮食中GABA 富集主要利用此途径实现。豆科类双子叶植物，豌豆、鹰嘴豆、大豆等通过多胺降解途径，利用二胺氧化酶降解腐胺实现富集GABA 的贡献率占30%左右。GABA 支路是三羧酸（TCA）循环拓展处理过程中形成一个分支，仍是粮食富集GABA 主要代谢通路，由以下环节组成：

图1 GABA 支路代谢路径Fig.1 Metabolic pathway of GABA branch

GABA 支路代谢第一环节是以谷氨酸为底物，经谷氨酸脱羧酶催化，α 位上的羧基在细胞质中形成GABA 和 CO2；第二环节发生在线粒体中，以GABA为底物，经GABA 转氨酶催化，GABA 与丙酮酸或α-酮戊二酸发生可逆反应，产物为琥珀酸半醛；第三环节是以琥珀酸半醛（SSA）为底物，经琥珀酸半醛脱氢酶（SSADH）催化，发生氧化脱氢反应形成琥珀酸，还有一种情况是SSA 在琥珀酸半醛还原酶催化下，生产4-羟基丁酸（GHB）。最后通过琥珀酸进入三羧酸循[18-20]。Ludewig F[21]以拟南芥对象，敲除其中调控琥珀酸半醛脱氢酶表达的基因，然后对拟南芥进行强光及热激处理，结果显示拟南芥中活性氧和GABA含量显著提高，该研究证实了植物代谢中GABA 之路的存在，为植物代谢法富集GABA 提供理论依据。γ-氨基丁酸支路代谢路径见图1 所示[19]：

GAD 是一个 5′-磷酸吡哆醛（PLP）依赖型酶，也是GABA 支路代谢的关键限速酶。植物中GAD 含有钙调蛋白（CaM）结合区，其活性由Ca2+和 H+共同调控，也与GAD 辅酶-磷酸吡哆醛（PLP）以及Glu 底物浓度有关[4，22]。当粮食种子及组织受到外界刺激（低氧、低温、强光、冻融、机械损伤）时，体内氢、钙离子浓度会随着增加，这样Ca2+与CaM 结合形成Ca2+/CaM 复合体，H+能刺激 GAD 基因表达，提高 GAD 活性，进而增加GABA 的合成。

GABA-T 是催化GABA 生成琥珀酸半醛的关键限速酶，琥珀酸半醛在SSADH 作用下，发生脱氢反应形成琥珀酸，脱下的氢被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）利用，生产还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），此酶联反应离不开GABA-T。它耐热性较差，在偏碱性环境下，有助于GABA 与磷酸吡哆醛之间形成 Shiff 碱，与此同时GABA 上 γ-碳原子-CH发生去质子化和重新质子化反应，这样可成功的将氨基转移给α-酮戊二酸[23]。

植物中SSADH 属于醛类脱氢酶 （ALDHs）家族，通过消耗ATP 来激活对琥珀酸半醛的专一性催化功能，酸度值在9.0～10.0 之间效果较好，分子量在14～220 kD 之间，分布于植物线粒体中，活性受NADP+和氧化态NAD+辅酶的影响较大，其中氧化态NAD+对SSADH 酶活性影响更明显，还原态NAD 对SSADH 有抑制作用，当两者达到等值时，SSADH 的活性会下降近90%，当还原态是氧化态的2 倍时，SSADH 活性丧失[24]。

因此，目前很多植物代谢法富集GABA 的研究，主要是增加GAD 及GABA-T 活性，进而达到GABA积累的目的。Paidaeng Khwanchai[25]通过优化浸泡发芽条件，将 5 种糙米中GAD 活力提高了10～100 倍。Xu J 等[26]对大豆发芽过程中酶活变化情况进行研究，发现大豆发芽温度为19 ℃和25 ℃、发芽时间为102 h时，GABA-T 活力呈现先下降后上升的趋势，然而发芽温度为32 ℃时，GABA-T 活力正好相反。据报道盐胁迫处理大豆根中游离多胺时，DAO 活力会增加，GABA 富集量增加 11～17 倍[27]。虽然多胺降解途径是GABA 植物代谢的另一条重要途径，但在单子叶植物中富集GABA 的能力远低于GABA 支路。

2 植物代谢法富集粮食GABA 的研究

植物代谢法包括生长代谢与应激代谢两种方式，生长代谢是指利用食品原料，在浸泡、发芽等处理过程中发生一系列生理变化与酶活性变化来实现富集GABA 的方法；应激代谢是通过低氧、盐胁迫、冷热刺激、机械损伤及微波、红外照射、脉冲强光等技术处理后，植物或种子为适应外界环境变化，引起内源性渗透条件物质、相关酶、基因表达等方面出现一系列应激变化，促使GABA 在植物体内迅速累积的代谢方法[28]。主要工艺是先浸泡后发芽，通过优化两个环节的诸多因素，同时辅以其他应激技术手段实现富集目的，具有操作简单，安全性高，环境污染低，富集后可直接应用于食品加工等优点，现已成为领域研究热点。

2.1 米类粮食

米类粮食中有关GABA 富集的研究，主要集中糙米、小米、玉米等作物。糙米是稻米加工中，保留了大部分蛋白、糊粉层和胚等营养成分，经发芽处理后比精米更具健康效益。因发芽过程中一些蛋白酶、淀粉酶等内源酶被激活，如蛋白酶水解蛋白质产生大量氨基酸，使氨基酸含量增加、比例更合理，除了基本营养成分外，还含有阿魏酸、谷维素和 γ-氨基丁酸等活性物质，导致谷物的营养成分及食用价值得以提升[29]，有关GABA 提升尤为明显。关于发芽糙米富集GABA 研究始于日本，有关浸泡和发芽条件的优化研究现已成熟，市售发芽糙米品类丰富。Karladee D 等[30]研究了不同发芽时间及品种对GABA 含量的影响，结果显示随着发芽时间延长，21 个品种GABA 含量先上升后下降，0～12 h 之间 GABA 含量持续增加，24 h 出现最大值（17.87 mg·100 g-1），之后缓慢下降为5.91 mg·100 g-1（36 h）和1.36 mg·100 g-1（48 h），表明发芽时间不宜过长。Kim H Y 等[31]为探究糙米不同部位在萌芽期间GABA 含量变化，将糙米分为壳体、糙米和芽三部分，以不同部位为研究对象，发现萌芽前后，三个部位GABA 含量均有不同程度增加，分别提高到 3.34、26.84 和 6.04 mg·100 g-1，整体GABA 含量增加107.43%。此外，浸泡液组分变化对谷物发芽富集GABA 也有一定影响，Liu R[32]用电解水对糙米进行浸泡，同时辅以超声技术可显著提高糙米GABA 含量，其中酸性电解水更有助于GABA 的积累。在发芽第4 天时，酸性电解水处理组与对照相比，GABA 含量显著提升，两者分别提高了39.76% 和 3.61%，是糙米和精米的2 倍和7 倍。Saikusa[33]在对稻米食用品质改良的研究中，发现稻米胚芽部分经浸泡处理后，GABA 积累量明显。为此启发了研究者，谷物加工中一些副产物如米糠、胚芽可以用来富集GABA。当米糠中胚芽含量达到60%时，每克米胚芽可富集0.17 g GABA。该研究不仅丰富了GABA 生物合成原料，更开辟米糠富集GABA 的新思路。但米糠富集GABA 更多采用微生物发酵技术，在次不进一步阐述。

有关小米、玉米通过发芽富集GABA 的报道也较多。宁亚维[34]优化浸泡温度、浸泡时间、发芽温度、发芽时间，使小米糙米中GABA 质量分数可达184.75 mg·100 g-1，较优化前提高了 2.76 倍。程建军[35]优化催芽温度及CaCl2溶液浓度，得出发芽小米中 GABA 含量为 251.46 mg·100 g-1，比初始含量增加了2.9 倍。Sharma S 等[36]为增加小米生物活性物质，对发芽条件进行优化，发现GABA 含量从发芽前6.36 mg·100 g-1增加到 35.70 mg·100 g-1，表明发芽产品营养价值更好。Li X[37]采用弱酸性电解水浸泡小米，使发芽小米GABA 含量增加21%。Paucar-menacho LM等[38]以黑玉米为原料，通过优化发芽条件，使GABA含量从 15.27 mg·100 g-1增加到 53.17 mg·100 g-1。

此外，发芽联合金属离子、低氧、通气、微波、超高压等胁迫技术，能大幅度提高GABA 含量，但不同胁迫方式及发芽条件对GABA 富集程度有较大影响。张颖等[39]研究通气及金属离子胁迫对发芽糙米GABA 含量的影响，发现Ca2+和Al3+能大幅度提升糙米 GABA 含量，Ca2+浓度 35 mmol·L-1、通气量1.5 L·min-1条件下，GABA 含量达到 28.18 mg·100 g-1，比对照提高了64.42%。王勃[40]通过脉冲强光技术促进糙米发芽过程富集GABA，浸泡12 h 后，对单层糙米进行脉冲强光照射，单次能量400J、闪照次数277次、闪照距离11.3 cm，此条件下发芽糙米中GABA含量可达到345.7 mg·100 g-1。真空处理发芽稻谷可使GABA 含量提高50.39%[41]。范明成[42]发现超加压处理可增加发芽糙米GABA 含量，且能提升发芽糙米酒的滋味及风味。Junzhou Ding 等[43]在红米发芽的过程中辅助超声处理，将GABA 从原先的2.91 mg·100 g-1提升至75.82 mg·100 g-1。以上研究发现，不同胁迫方式对米类粮食GABA 增加程度存在差异，因不同诱导方式积累GABA 的机制迥然不同，Kinnersley[44]认为，植物体内GABA 富集主要受Ca2+、酸度值及底物水平三方面影响。低盐、低温和高温环境变化积累GABA 的机制是通过增加Ca2+浓度，达到GABA 在粮食原料内富集目的；机械损伤和低氧胁迫处理是增加原料细胞质中H+浓度，提高GAD 活性实现GABA含量的增加；粮食发芽代谢过程中，有机酸得到增加，进而提高了谷氨酸底物浓度，使GABA 在谷物中得到富集。超声波富集是利用超声过程释放出的能量，引起粮食合成GABA 所需酶的分子构想发生改变，进而导致酶的活力发生变化。

2.2 豆类粮食

在豆类粮食中，有关大豆、蚕豆、赤小豆富集GABA 的技术研究较多。尤其是大豆，浸种、高温萌发、低氧胁迫、冻融、低盐、超声波等胁迫手段均有报道。这些胁迫方法不仅能促进植物种子萌发，还对其生理特性及物质积累具有重要影响。Morrison 等[45]认为随着浸种时间延长，不同品类大豆GABA 含量均有所增加，且增加程度与浸泡温度、时间密切相关。王淑芳[46]对发芽大豆进行48 h 低氧处理，GABA 产量达到 1.97 mg·g-1，是随机组的 1.56 倍。Yang 等[47]研究证实，大豆在低氧条件下萌芽24 h 内，其GABA含量显著增加，同时GAD 和DAO 两种酶的活性也随之升高。Huang 等[48]研究发现，发芽3 d 大豆的营养价值显著高于大豆原料，发芽后γ-氨基丁酸含量增加了10 倍，表明发芽大豆是各种营养素和生物活性物质的良好来源。曾晴等[49]以东北大豆为原料，优化了大豆发芽富集GABA 的培养液组分，确定CaCl22.0 mmol·L-1、NaCl 100 mmol·L-1时，富集得到的GABA 含量为（269.93±4.73）mg·100 g-1，比大豆发芽前提高了约 10 倍。Ueno 等[50]将浸水大豆在-20、-80 ℃及-180 ℃条件下进行冻融处理，与对照相比，GABA含量显著增加，由此可推测冻融处理可作为提高粮食GABA 积累的重要手段。Yang 等[51]先采用超声波（0～300 W）处理大豆种子，之后正常萌芽，当萌芽5 d后，发现GABA 含量与超声功率成正比，当超声功率为300 W 时效果最好，GABA 含量相比对照提升了43.39%。

据报道发芽及外界刺激方法能有效改善蚕豆营养组分和降低抗营养因子。杨润强等[52]采用低氧协同氯化钠富集蚕豆GABA，先正常环境下培养1.5 d、培养液酸度值为3.5，再低氧协同NaCl 处理4 d，发现培养时间、培养pH 和胁迫时间显著影响发芽蚕豆GABA 积累，并且三者对GABA 含量影响的顺序是：培养pH＞培养时间＞胁迫时间，在此条件下，GABA含量可达 1.06 mg·g-1DW，是对照 7.57 倍。陈惠[53]对发芽蚕豆富集GABA 培养液组分进行优化，发现谷氨酸钠（MSG）、CaCl2和 VB6 对发芽蚕豆 GAD 活性和 GABA 含量均有显著影响，GABA 含量从 1.08±0.01 mg·g-1增加到 1.98±0.09 mg·g-1。王婷婷[54]发现发芽处理可提高蚕豆蛋白、淀粉、还原糖含量，同时GABA 含量比发芽前提高49.26 倍，说明发芽富集蚕豆效果显著，并可显著提高蚕豆的营养价值和经济效益，可用于开发富含γ-氨基丁酸的功能食品。

Liao 等[55]采用冷休克联合发芽处理赤豆，GABA含量达到201.2 mg·100 g-1，相比正常赤豆γ-氨基丁酸含量提高了150 倍。Runqiang Yang[56]对大豆冷冻发芽积累GABA 的机制研究，发现冷冻发芽大豆中GABA 含量在解冻前无明显变化。解冻后，与对照相比，液氮闪蒸冷冻和-80 ℃处理12 h GABA 含量分别增加83.9%和82.9%。表明GABA 的形成主要发生在解冻过程中。然而，在解冻过程中，GAD、DAO 和氨基醛脱氢酶（AMAD H）的活性下降。根据发芽大豆中丙二醛（MDA）含量和微观结构实验，表明低温冷冻（＜-20 ℃）保持细胞结构的完整性，而组织和细胞膜在解冻过程中被打破。GABA 的形成是由于酶在解冻过程中与底物的充分接触，而不是依靠酶活性富集GABA 提供了证据。

2.3 麦类粮食

麦类中含有丰富的蛋白质和GAD 酶，适合作为GABA 富集的原料。国内外对于小麦、大麦、青稞等作物均有萌动富集GABA 的研究。Cha M N[57]对浸泡后大麦进行发芽处理，发现浸泡温度25 ℃、浸泡时间24 h，发芽温15 ℃、发芽时间36 h 的条件下，GABA含量达到20.9 mg·100 g-1，是原麦的14.6 倍。凌志洲[58]以青稞为萌芽原料，对浸麦工艺条件进行优化，得出工艺参数为浸6 断2、浸麦时间24 h、浸麦温度25 ℃、萌发时间48 h、萌发温度25 ℃、相对湿度90%及光照强度7 500 Lx 时，青稞GABA 含量最高（47.672 mg·100 g-1）。同时也有研究[59]指出，氮气厌氧联合醋酸钠处理青稞萌芽，GABA 含量可达到14.3 mg·100 g-1，虽比原料提高了 3 倍，但相比其他处理方法效果不明显。除大麦、青稞等常见品种外，荞麦也存在发芽富集GABA 的可能，朱云辉[60]研究低氧联合NaCl 胁迫下外源Ca2+对发芽苦荞γ-氨基丁酸富集的影响，发现GAD 活力和GABA 含量均与NaCl 浓度密切相关，在 10 mmol·L-1NaCl 溶液处理时两者均出现最大值。在此基础上，添加3 mmol·L-1Ca2+处理发芽苦荞，GABA 富集量可达到492.31 μg·g-1DW，低氧联合NaCl 胁迫1.16 倍，说明外源Ca2+可提升GAD 活力，增加GABA 的富集量。

3 展望

GABA 作为新兴食品功能因子，对人体健康至关重要，研究其富集技术提高粮食中GABA 含量具有重要意义。通过对目前有关植物代谢法富集粮食GABA 效果及工艺的梳理，发现植物代谢法已经成功应用于各种粮食富集GABA 及提升营养品质方面的研究。糙米、大豆、小米、青稞、玉米等作物通过发芽、环境胁迫富集GABA 相关研究较多，且通过植物代谢富集技术使其GABA 含量、营养特性和加工特性均有显著提升，这对粮食深加工、富含GABA 功能产品创制，提升粮食作物附加值，促进粮食产业化、标准化发展具有深远影响。但总体来说，目前发芽联合应激代谢富集粮食GABA 的工艺及机制的研究还是有限，缺乏对新兴外界因素影响的探索性研究，还有脉冲强光、冻融、微波等现代胁迫方式的作用机制需要进一步挖掘，与此同时，现有富集粮食GABA 工艺停留在试验阶段，缺乏对富含GABA 芽类食品功能性的研究，无法满足市场及消费者需求。