鸡传染性支气管炎病毒GX-YL5株S蛋白在昆虫杆状病毒表达系统的表达及其免疫原性

张 愉，袁 园，苏艳静，廖健淇，张 韬，张丽娟，范文胜，韦 平，磨美兰

(广西大学 动物科学技术学院，广西 南宁 530005)

鸡传染性支气管炎(avian infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性、呼吸道传染的病毒性疾病，呈世界范围流行。近年来,IB流行更加严重，给养殖户带来极大的经济损失[1]。IBV基因组十分容易发生突变、缺失、插入及毒株间的同源重组，导致新基因型甚至新血清型不断出现，且各血清型间交叉保护作用强弱不一[2-3]。IBV变异性极大以及具有地区流行特征，使得现有商品疫苗基本不能提供完全有效的保护[4]，且目前常用的疫苗在安全性和免疫原性方面存在缺陷[5-6]。因此，非常有必要研发与当地IBV优势血清型相吻合且高效安全的新型疫苗。

S蛋白是IBV最大的结构蛋白，在病毒入侵细胞时，S蛋白被宿主细胞蛋白酶裂解为S1和S2等2个亚型糖蛋白。S1蛋白主要产生血凝抑制抗体和诱导大部分病毒中和抗体[7-8]，是最重要的结构蛋白和保护性抗原，还决定了IBV毒株的血清型[1,9]；S2蛋白在大多数毒株中高度保守，主要激活病毒与宿主细胞融合，诱导中和抗体的抗原决定簇具有免疫优势[10-11]。因S蛋白相对分子质量太大难以表达，很少有关于全长S蛋白表达的报道。目前，国内外对IBV S基因的表达大多数都局限于对S1基因或截短的S或S1基因的研究[9,12]，尚未见其全长S蛋白表达的报道。

广西家禽养殖量很大，IB近年来严重威胁广西养殖业[13]。本试验以IBV广西地方流行毒株优势血清型代表株GX-YL5为对象，应用昆虫杆状病毒真核表达系统表达其S蛋白，制备了重组S蛋白的兔多抗血清，并验证其反应原性和免疫原性，以期为研究IBV S蛋白的生物学功能、基因工程亚单位疫苗以及诊断试剂等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体、细胞、病毒及试验动物pFastBacTM/HBM-TOPO转座载体和DH10BacTM感受态细胞购自Invitrogen公司；DH5α大肠杆菌感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；Sf9昆虫细胞、IBV GX-YL5毒株、对照毒株传染性法氏囊病病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、马立克病毒(MDV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病病毒(ALV)和禽偏肺病毒(aMPV)为广西大学养禽与禽病学研究所保存；新西兰大白兔购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 主要试剂总RNA抽提试剂盒和DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；E.Z.N.A.®Endo-free Plasmid DNA Mini Kit购自OMEGA公司；BamHⅠ和HindⅢ购自TaKaRa公司；Sf-900TMⅡ SFM昆虫细胞培养基购自GIBCO公司；SIM SF昆虫培养基购自北京义翘神州科技有限公司；抗His标签鼠源单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG和FITC标记的羊抗鼠IgG购自北京全式金生物技术有限公司；HRP标记的羊抗鸡IgY购自Abbkine公司；FITC标记的羊抗兔IgG购自康为世纪生物公司；Platinum®Taq DNA Polymerase High Fidelity和转染试剂CellfectinⅡReagent购自Invitrogen公司。

1.3 引物的设计与目的基因的扩增根据GenBank中IBV GX-YL5毒株的序列(HQ848267.1)设计S基因对应的引物，上游引物P1：5′-AATTTGTTTCATTCTGGTAATTATGTG-3′；下游引物P2：5′-AGCAGACTTTTTAGGTCTGTATTG-3′。后期用于重组杆粒PCR鉴定及转染后PCR鉴定的M13载体通用引物，上游引物P3：5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′；下游引物P4：5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′。引物交由北京华大基因公司合成。将本课题组前期构建的pEasy-HBM-S重组质粒保存菌重新增殖后，进行质粒抽提，利用Platinum®Taq DNA Polymerase High Fidelity扩增S基因片段。

1.4 重组转座载体的构建与鉴定将获得的S基因片段的纯化产物与pFastBacTM/HBM-TOPO利用拓扑反应进行平末端连接，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，通过菌液PCR、酶切鉴定及测序对其进行鉴定。将鉴定完全正确的阳性单克隆菌液进行质粒抽提，获得重组转座载体pFastBacTM/HBM-TOPO-S。

1.5 重组杆状病毒的获取与纯化抽提S基因重组转座载体保存菌的质粒后，转化MAX Efficiency®DH10BacTMCompetentE.coliCells，经Gen、Kan、Tet 3种抗生素及IPTG、X-gal进行蓝白斑筛选，挑取白色单克隆并用M13引物进行菌落PCR鉴定。当扩增产物同时出现目的片段(2 500 bp+插入目的基因片段)和300 bp的条带时，再重新划板筛选，继续挑取纯白菌落，直至扩增产物只出现目的片段(2 500 bp+插入目的基因片段)，则纯化完成。抽提转化菌质粒获得纯化的重组杆粒，通过脂质体介导转染Sf9细胞以获得重组杆状病毒rHBM-S。

1.6 重组蛋白的鉴定

1.6.1IFA鉴定 经PCR鉴定完全正确的重组杆状病毒继续在Sf9细胞中进行增殖培养至第4代，接种处于对数生长期的Sf9细胞(同时设空载体对照和细胞对照)，培养72 h待细胞出现病变后，进行IFA鉴定。以鼠抗His标签的单克隆抗体(1∶500稀释)为一抗，以FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(1∶300稀释)为二抗，倒置荧光显微镜观察记录结果。

1.6.2Western blot鉴定 将P4代重组杆状病毒接种于Sf9细胞中(同时设空载体对照和细胞对照)，培养72 h，分别收集培养上清和细胞沉淀，进行Western blot分析。分别以鼠抗His标签单克隆抗体和本课题组制备保存的抗GX-YL5毒株的鸡多抗血清(1∶2 000稀释)为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG和HRP标记的羊抗鸡IgY(1∶5 000稀释)为二抗，ECL显色观察蛋白的表达。

1.7 重组S蛋白的纯化和多抗血清的制备按照前期摸索的重组S蛋白表达的最佳条件大量表达后，采用Ni-NTA树脂进行重组蛋白的纯化，纯化步骤按说明书进行，收集洗脱液进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色鉴定。纯化的重组S蛋白经超滤管浓缩后，测定其蛋白质量浓度，并调整蛋白质量浓度至500 mg/L，免疫健康成年新西兰大白兔，共免疫4次，每次免疫间隔时间为10 d。首免使用1 mg重组S蛋白与弗氏完全佐剂等比例乳化混匀，加强免疫使用500 μg重组S蛋白与等量弗氏不完全佐剂等比例混匀，第4次免疫后10 d进行心脏采血并分离血清。首免前采血作为阴性血清对照。

1.8 多抗血清的特性验证

1.8.1IFA验证 对数生长期Sf9昆虫细胞感染重组杆状病毒rHBM-S后72 h进行IFA鉴定。一抗使用制备的兔抗S蛋白多抗血清(1∶200稀释)，二抗使用FITC标记的羊抗兔IgG(1∶300稀释)，同时设细胞对照。

1.8.2Western blot验证 对数生长期Sf9细胞感染重组杆状病毒rHBM-S，72 h细胞出现明显的细胞病变时收集表达产物进行Western blot鉴定。用制备的兔抗S蛋白多抗血清(1∶4 000稀释)作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)作为二抗进行检测，同时设阴性血清对照。

1.8.3间接ELISA测定抗体效价 用纯化重组S蛋白作为包被抗原，包被质量浓度为10 mg/L，包被后用5%脱脂奶粉封闭液于37℃湿盒中封闭2 h，采用间接ELISA方法检测重组S蛋白兔多抗血清抗体效价。将多抗血清作为一抗，用PBST稀释成1∶50，1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，1∶25 600，1∶51 200共11个稀释度；首免前的阴性血清作为阴性对照，同等稀释度稀释；用HRP标记的羊抗兔IgG(1∶2 000稀释)作为二抗；Bio-Rad酶标仪测定各孔在450 nm波长下的D值。若兔多抗血清不同稀释度的D值/同等稀释度阴性血清的D值>2.1，则判定为阳性，反之，则判定为阴性。以最高抗体稀释度为阳性的血清稀释度的倍数作为该血清的抗体效价。

1.8.4多抗血清的特异性鉴定 采用间接ELISA方法，分别以IBDV、NDV、MDV、AIV、ALV、aMPV病毒液、阴性尿囊液和纯化的重组S蛋白作为抗原，多抗血清(1∶25 600稀释)作为一抗，HRP标记的羊抗兔IgG(1∶2 000稀释)作为二抗，酶标仪读取450 nm波长下的D值。

1.8.5中和试验 参照本课题组方法[14]取18～20日龄健康鸡胚的气管制备气管环。参照Reed-Muench法计算GX-YL5株的鸡胚气管环半数感染量(TOC-ID50)和采用稀释多抗血清固定病毒的方法进行TOC中和试验[3]。设立GX-YL5毒株多抗血清阳性对照和阴性血清对照。

2 结果

2.1 S基因的扩增及重组转座载体的鉴定经RT-PCR得到大小为3 453 bp的S基因，与目的片段预期大小相符。重组转座载体pFastBacTM/HBM-TOPO-S的 PCR鉴定表明获得约为3 453 bp的S基因条带，BamHⅠ单酶切得到与预期大小相符的8 277 bp片段，BamHⅠ和HindⅢ双酶切得到与预期大小相符的4 670 bp和3 607 bp的2个片段(图1)。测序结果正确，表明成功构建了S基因的重组转座载体。

2.2 重组杆状病毒的PCR鉴定将重组转座质粒pFastBacTM/HBM-TOPO-S转化DH10Bac细胞，经初步筛选后菌落PCR鉴定可见300 bp和5 953 bp 的2条片段，重新划线纯化筛选后，菌落PCR鉴定只含有5 953 bp的条带，条带大小均符合预期(图2)，表明纯化的重组杆粒构建成功。

将重组杆粒转染Sf9细胞得到的重组杆状病毒用S基因特异性引物及M13通用引物进行PCR鉴定。结果显示，S基因特异性引物PCR扩增出3 453 bp 的条带，M13载体通用引物PCR扩增出6 043 bp(3 453 bp+2 500 bp)的条带，且空杆粒扩增产物为300 bp，未感染细胞M13引物PCR鉴定没有条带(图3)，表明获得纯化的重组杆状病毒rHBM-S。

M.1 kb DNA Ladder；1.pFastBacTM/HBM-TOPO-S双酶切鉴定；2.pFastBacTM/HBM-TOPO-S单酶切鉴定；3.S基因特异性引物菌液PCR鉴定

M1.1 kb DNA Ladder；M2.Trans 2kTM 2000 DNA Marker；1.纯化的rHBM-S PCR产物；2.未纯化的rHBM-S PCR产物；3.空杆粒PCR产物

2.3 重组S蛋白的IFA鉴定将鉴定正确的重组杆状病毒接种处于对数生长期的Sf9细胞，培养72 h待细胞出现病变后，进行IFA鉴定。IFA检测结果显示，感染rHBM-S的细胞胞浆中出现了极强的绿色特异性荧光，空载体对照组和细胞对照组无特异性荧光(图4)，表明重组S蛋白已获得表达。

A.感染rHBM-S的细胞；B.空载体对照；C.细胞对照

2.4 重组S蛋白的Western blot鉴定Western blot鉴定结果显示，重组S蛋白可与抗His标签鼠源单克隆抗体(图5A)及抗GX-YL5毒株的多抗血清(图5B)反应，在感染细胞沉淀均出现与天然蛋白大小一致的190 kDa特异性蛋白带。

M.蛋白质相对分子质量标准(10～180 kDa);1.感染细胞培养上清;2.感染细胞沉淀;3.空载体对照;4.细胞对照。A.重组S蛋白与抗His标签鼠源单克隆抗反应；B.重组S蛋白与抗GX-YL5毒株的多抗血清反应

2.5 多抗血清的特性验证

2.5.1多抗血清的IFA鉴定 IFA检测结果表明，制备的多抗血清能够与表达的重组S蛋白结合，感染的细胞表面呈现较强的特异性荧光，而细胞对照未检测到特异性荧光信号(图6)，说明制备的抗S蛋白多抗血清具有良好的特异性。

A.感染rHBM-S的Sf9细胞；B.细胞对照

2.5.2多抗血清的Western blot鉴定 Western blot鉴定结果显示，制备的多抗血清与感染重组杆状病毒rHBM-S的表达产物反应，出现与目的蛋白大小一致的190 kDa特异性蛋白带，而阴性血清未出现相应目的条带(图7)，说明制备的血清特异性较好，且能够用于Western blot验证。

M.蛋白质相对分子质量标准(10～180 kDa)；1.S蛋白多抗血清；2.S蛋白阴性血清

2.5.3多抗血清抗体的间接ELISA效价测定结果 将纯化后的重组S蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA检测多抗血清的抗体效价。比较多抗血清不同稀释度下D450值及P/N值，确定制备的S蛋白多抗血清的抗体效价为1∶25 600(表1)。

表1 S蛋白血清抗体效价检测结果 D450值

2.5.4多抗血清的特异性鉴定结果 间接ELISA检测结果表明，该多抗血清对重组S蛋白有很强的特异性，与参考毒株IBDV、NDV、MDV、AIV、ALV、aMPV没有交叉反应(表2)。

表2 多抗血清特异性鉴定

2.5.5多抗血清的中和滴度检测结果 根据Reed-Muench法测得GX-YL5毒株TOC-ID50为10-6.46/0.2 mL。气管环中和试验结果显示，S蛋白多抗血清中和滴度为1∶512，GX-YL5多抗血清阳性对照的中和滴度为1∶512，且阴性血清对照无中和作用，表明制备的兔抗S蛋白多抗血清对IBV具有明显的中和作用，重组S蛋白具有良好的免疫原性。

3 讨论

S基因是IBV最主要的抗原基因，其编码的S蛋白是IBV最大的结构蛋白[15]。S蛋白具有许多重要的生物学功能，包括含有与病毒中和、血凝抑制抗体、细胞吸附、组织亲和性、毒力、血清型特异性有关的抗原位点[16-17]，也是IBV蛋白中变异程度最大的结构蛋白[18]，因此表达S蛋白作为诊断试剂或研发基因工程亚单位疫苗都是比较理想的。

不同的外源蛋白在杆状病毒表达系统中的表达量有所差异，获得最大的蛋白表达量是研发重组亚单位疫苗和大量表达蛋白制备多克隆抗体的前提和基础。因IBV S蛋白相对分子质量太大难以表达，大多研究都是基于S1蛋白或截短的S蛋白的表达。沈行燕[19]利用原核细胞表达了IBV-ZJ971毒株的 S蛋白，但大小只有118 kDa，且表达量不高。唐应华等[20]运用昆虫杆状病毒对IBV DS10株的S基因进行了表达，但只是在研究中利用IFA试验鉴定了其重组蛋白的反应原性，未对其相对分子质量进行考究。LIU等[21]的报道，他们应运用杆状病毒表达系统成功表达出了IBV H120株的S蛋白，蛋白大小为170 kDa，与IBV S蛋白的天然大小(170～200 kDa)较接近，但是表达的毒株不是地方流行株。目前，关于在原核表达系统中制备IBV M和E蛋白多克隆抗体的研究已有报道[22-23]，但还没有在真核表达系统表达IBV全长S蛋白并进行多克隆抗体制备的相关研究。

本试验对GX-YL5株S蛋白的全长相对分子质量进行估算，其相对分子质量应约为128 kDa，采用了具有昆虫细胞能识别和剪切的HBM信号肽的pFastBacTM/HBM-TOPO杆状病毒表达系统进行表达，经过反复试验成功在真核表达系统中获得了相对分子质量约为190 kDa的全长S蛋白，与天然S蛋白相对分子质量大小相符，说明表达的S蛋白在真核系统中得到了较为完备的修饰。经过进一步纯化进而免疫新西兰大白兔，制备的多抗血清在IFA、Western blot和特异性验证试验中都呈现较好的特异性。此外，该多抗血清的ELISA抗体效价高达1∶25 600，中和试验滴度为1∶512，与GX-YL5全病毒多抗血清相同，说明S蛋白多抗血清对IBV具有明显的中和作用。本课题组目前分别表达了IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的S蛋白、S1蛋白、M蛋白和E蛋白，下一步考虑共感染制备病毒样颗粒疫苗，并对其免疫原性和免疫保护作用及初步临床应用进行研究。

本试验利用昆虫杆状病毒真核表达系统成功表达了IBV全长S蛋白并制备了多抗血清，且具有良好的反应原性和免疫原性，为进一步研究IBV S蛋白的生物学功能、研发诊断试剂、制备基因工程亚单位疫苗和病毒样颗粒疫苗奠定了基础，也为利用昆虫杆状病毒表达系统进行其他冠状病毒结构蛋白的表达及多抗的制备提供了借鉴和参考。