HPLC法测定不同产地天南星中夏佛塔苷及异夏佛塔苷的含量

李 欣 黄旭东 杨成梓，▲

1.福建中医药大学药学院，福建福州 350122；2.福建省级中药原料药质量鉴定技术服务中心，福建福州 350122

天南星为天南星科天南星属植物，性温，味苦辛[1]。用于顽痰咳嗽，风瘫眩晕等[2]。据报道，天南星中含多类活性物质，包括黄酮苷类[3-5]、多糖[6-7]、氨基酸[8]及毒针晶[9]等其他成分[10-11]。研究表明，天南星富含黄酮类成分，其中夏佛塔苷与异夏佛塔苷两种黄酮苷的含量相对较高[12]。现代药理学研究表明，天南星总黄酮提取物具有一定的镇痛作用[13]，并对肿瘤细胞增殖具有抑制作用[14]。目前有关天南星黄酮类成分的报道主要为总黄酮提取分离及药理活性研究[3，15-17]，其物质基础相关研究较少，且不同产地的天南星药材可能因地域环境、条件的不同而导致其质量上存在差异性，故本实验采用高效液相色谱法测定天南星中夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量，对比不同产地天南星药材中两种成分的含量差异，为其质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱分析仪（日本岛津公司），Syncronis aQ C18色谱柱（4.6 mm ×250 mm，5μm），HH-2型水浴锅（上海亚荣生化仪器厂），KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20190704），甲醇（色谱纯，默克股份两合公司，批号：L1003207913），乙腈（色谱纯，默克股份两合公司，批号JA081230），甲酸（色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：F1627027），水为超纯水。

1.3 药材与样品

天南星（经福建中医药大学杨成梓教授鉴定为天南星科植物天南星的正品，样品烘干，粉碎，过4号筛备用）。夏佛塔苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111912-201703，纯度≥93%）；异夏佛塔苷对照品（成都普斯生物科技股份有限公司，批号：PS0479-0020，纯度≥98%）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Syncronis aQ C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇（A）乙腈（B）-0.4%甲酸水溶液（D）为流动相（7 ：13 ：80），等度洗脱，流速 0.9 ml/min，柱温为30 ℃，检测波长为 334 nm，进样量 10 μl。见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称定夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品适量，置5 ml量瓶中，加适量甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，制成夏佛塔苷、异夏佛塔苷对照品溶液母液，加适量甲醇稀释夏佛塔苷及异夏佛塔苷混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取供试品粉末1 g，量取10 ml 60%乙醇，称定质量，超声（功率：600 W，频率：45 kHz）60 min，放冷，在称定其质量，用60%乙醇补足减失重量，以4000 r/min离心5 min，过0.45 μm的有机微孔滤膜即得。

图1 供试品色谱图（A），对照品色谱图（B）

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml至 10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，分别精密量取10 μl，注入高效液相色谱仪，观察并记录色谱图。以峰面积为纵坐标，以混合对照品的浓度为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y夏佛塔苷=24 293X- 14 891（r=0.9999），Y异夏佛塔苷=21 027X- 28 253（r=0.9999），结果说明夏佛塔苷、异夏佛塔苷分别在18.11～108.62 μg/ml，6.14～36.84 μg/ml内线性关系良好。

2.4.2 精密度考察 分别精密吸取同一份混合对照品溶液5次，各10 μl，分别注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算RSD，得到夏佛塔苷含量RSD值为0.73%及异夏佛塔苷为0.69%，表明精密度良好。

2.4.3 稳定性考察 取同一份混合对照品溶液，分别于 0、4、8、12、24 h 等时间点进样，精密吸取 10 μl注入高效液相色谱仪，得到夏佛塔苷含量RSD值为1.33%及异夏佛塔苷为0.91%，表明样品的稳定性良好。

2.4.4 重复性考察 称取天南星粉末5份，精密吸取10 μl注入高效液相色谱仪，得到夏佛塔苷含量RSD值为2.03%及异夏佛塔苷为1.78%，说明样品重复性好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取天南星粉末6份（批号为20190507），分别精密加入夏佛塔苷及异夏佛塔苷对照品溶液，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件，进样检测，结果见表1。

表1 天南星中夏佛塔苷、异夏佛塔苷的回收率

2.5 样品测定

精密称取不同产地，不同批次的天南星药材37批，按照条件2.3项下方法制备天南星供试品溶液，按照条件2.1项下进行含量测定。天南星药材中夏佛塔苷、异夏佛塔苷的含量测定结果见表2。不同产地天南星中夏佛塔苷、异夏佛塔苷的含量差异较大，夏佛塔苷的含量以四川最高、浙江最低，分别为55.346、0.006 μg/ml，异夏佛塔苷的含量以四川最高、东北最低，分别为 19.068、0.000 μg/ml。

3 讨论

3.1 流动相的选择

针对流动相体系，本实验分别对乙腈体系和甲醇体系进行考察，发现前期在乙腈体系下，后期在甲醇体系下洗脱，样品色谱峰分离度高，基线平稳。通过不同浓度的乙酸及甲酸水溶液作为流动相得出0.4%的甲酸水溶液作为流动相时样品及对照品的色谱峰分离度及保留时间相对较好。

3.2 提取条件的选择

本实验分别对提取溶剂、提取方法、提取时间进行了考察，结果表明样品用60%乙醇超声（功率：600 W，频率：45 kHz），提取60 min为最佳条件，其提取率最高。

3.3 色谱柱的选择

本实验首次采用Syncronis aQ C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），进行考察，利用三项流动相进行色谱考察与调整，得出良好的分离结果及保留时间，简单高速并节省成本。

本研究建立了一种利用HPLC同时测定天南星药材中夏佛塔苷和异夏佛塔苷的方法，具有快速准确、稳定性高的特点，可快速实现对夏佛塔苷和异夏佛塔苷的含量测定，有利于其质控的进一步研究。其分析结果表明，四川地区的天南星夏佛塔苷、异夏佛塔苷含量最高，在东北、浙江等地区的含量较低，不同产地间的差异性显著。反映出目前天南星在品种上存在质量参差不齐的问题，仅野生品种可能无法满足临床的应用需求，宜在四川、福建等地区有选择地建立规范化的种植基地，生产出质量稳定的药材或饮片供临床药用，保证临床用药的安全性、有效性。

表2 天南星中夏佛塔苷、异夏佛塔苷的含量测定（±s，μg / ml）

表2 天南星中夏佛塔苷、异夏佛塔苷的含量测定（±s，μg / ml）

编号 药材编号 产地 夏佛塔苷 异夏佛塔苷1 JN01 福建 3.176±0.005 0.433±0.003 2 FZ01 福建 4.969±0.006 0.299±0.006 3 SX01 福建 22.179±0.003 4.389±0.024 4 SX02 福建 19.351±0.005 3.828±0.002 5 SN01 福建 17.157±0.007 7.754±0.012 6 YTO1 福建 4.652±0.011 0.395±0.002 7 GZ01 贵州 25.274±0.012 2.590±0.006 8 GZ02 贵州 23.442±0.015 8.240±0.008 9 SCO2 四川 55.346±0.015 19.068±0.066 10 SC01 四川 54.164±0.001 13.904±0.033 11 HB01 湖北 16.195±0.003 2.537±0.005 12 HN02 湖南 11.288±0.004 1.008±0.002 13 HN01 湖南 10.220±0.003 2.010±0.063 14 AH02 安徽 13.628±0.004 1.661±0.001 15 AH04 安徽 12.574±0.006 2.247±0.003 16 JX01 江西 0.186±0.003 0.000±0.000 17 ZJ01 浙江 0.006±0.005 0.000±0.008 18 ZJ02 浙江 5.483±0.007 0.000±0.000 19 AG03 东北 1.465±0.008 0.000±0.000 20 AG04 东北 2.007±0.002 0.000±0.000 21 JL01 东北 1.421±0.005 0.351±0.005 22 JL02 东北 4.524±0.002 0.546±0.001 23 LN01 东北 0.547±0.001 0.000±0.000 24 YN01 云南 13.903±0.007 4.679±0.043 25 YN02 云南 14.419±0.006 1.354±0.017 26 CD01 四川 49.748±0.007 17.097±0.001 27 PC03 福建 0.208±0.004 0.000±0.000 28 WYS06 福建 9.504±0.014 0.655±0.001 29 PC04 福建 19.635±0.004 7.000±0.008 30 PC06 福建 19.351±0.004 3.828±0.006 31 WYS08 福建 11.286±0.009 10.192±0.006 32 PC08 福建 6.534±0.002 5.284±0.009 33 WYS05 福建 28.913±0.002 10.240±0.001 34 WYS07 福建 23.215±0.014 4.569±0.003 35 PC05 福建 1.730±0.003 4.187±0.004 36 PC07 福建 33.031±0.004 12.254±0.012 37 WYS09 福建 22.815±0.006 5.302±0.001 38 对照药材 - 1.040±0.005 0.000±0.000