HPLC法测定枳芩颗粒中黄酮类成分的含量

高红宁 潘雨柔 殷 奕 毛春芹 陆兔林

1.南京中医药大学药学院，江苏南京 210046；2.南京多康商贸有限公司，江苏南京 210000

枳芩颗粒是由枳实、黄芩、大黄、生姜等六味药材组成的医院制剂，具有清热泻火、消积解毒的功效，常用于治疗心脾胃脘有积热，实邪壅滞腑气不通所致疼痛、湿热下利等症。枳实为方中君药，2015年版《中华人民共和国药典》以测定辛弗林含量来控制枳实饮片质量[1]，国内外文献多以测定其黄酮类成分（柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷）来控制饮片质量[2-8]。黄芩为方中臣药，黄芩苷是其质量控制的主要药效成分，已有报道对含黄芩制剂中橙皮苷、柚皮苷、黄芩苷和新橙皮苷一种或几种成分进行含量测定[9-15]。本试验建立了以高效液相色谱法同时测定枳芩颗粒中4种黄酮类成分含量的方法，为整体控制枳芩颗粒的质量提供可靠、科学的实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

美国Agilent公司安捷伦1100 高效液相色谱仪，Chem Station 色谱工作站；昆山市超声仪器有限公司超声波清洗器；巩义市英峪予华仪器厂水浴锅；德国梅特勒公司AB104-L分析天平。

1.2 试药

柚皮苷对照品（批号：110722-201011）；橙皮苷对照品（批号：110722-201011）；新橙皮苷对照品（批号：111857-201102）；黄芩苷对照品（批号：110715-200514）；以上对照品均购自中国药品生物制品检定所。枳芩颗粒样品（实验室自制，批号：180112、180118、180123）。乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：汉邦Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）- 0.1 %磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～ 28 min，5% ～ 26% A；28～36 min，26% A；36～48 min，26%～40% A）；流速：1 ml/min；检测波长：280 nm；进样量：10 μl；柱温：30 ℃。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液的配制 分别精密称取柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷对照品适量，置5 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。分别精密量取单个组分对照品溶液，加甲醇配成每1 ml分别含柚皮苷0.194 mg、橙皮苷0.110 mg、新橙皮苷0.129 mg、黄芩苷0.453 mg的混合对照品液。

2.2.2 供试品溶液的配制 取枳芩颗粒适量，研细，精密称取1.00 g，置具塞锥形瓶中，加入25 ml甲醇，密塞，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷至室温，再称定质量，加甲醇补足损耗的质量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.45 μm的滤膜，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液配制 按照枳芩颗粒处方比例分别称取除枳实、黄芩以外的其余药材，按照枳芩颗粒制备方法分别制成缺枳实、缺黄芩、同时缺枳实和黄芩的阴性样品，按“2.2.2”项下供试品溶液的配制方法操作，制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

分别取供试品溶液、阴性对照溶液和混合对照品储备液各10 μl，按“2.1”项下色谱条件，注入高效液相色谱仪中，色谱图见图1。结果为阴性对照溶液在指标成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷的色谱峰位置上无吸收，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷分离良好，在各出峰处均无干扰，表明该方法的专属性良好。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品储备液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。以对照品质量浓度和峰面积积分值进行线性回归，求得柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷的线性回归方程、相关系数和线性范围，结果见表1。

表1 4种对照品的标准曲线、相关系数及线性范围

2.5 精密度试验

取上述对照品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，连续进样6 次，记录峰面积。结果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷峰面积RSD分别为0.34%、0.12%、1.43%、0.98%，表明仪器精密度良好。

图1 枳芩颗粒的HPLC色谱图

2.6 稳定性试验

取枳芩颗粒样品（批号：180118）1份，按照“2.2.2”项下制备方法得到供试品溶液，按上述色谱条件分别在 0、2、4、8、12、24 h 进样测定，结果橙皮苷、柚皮苷、黄芩苷和新橙皮苷的RSD分别为1.21%、1.72%、1.76%、1.98%，表明供试品溶液在24 h范围内稳定。

2.7 重复性试验

取枳芩颗粒样品（批号：180118）6份，每份1.00 g，精密称定，按照“2.2.2”项下方法制备得到供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黄芩苷平均含量（n= 6）分别为 5.7189、2.8744、3.4124、16.4962 mg/g，RSD 分别为1.50%、1.55%、1.62%、1.25%，表明该方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的枳芩颗粒样品（批号：180118）9份，每份0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入低、中、高3个质量浓度的混合对照品溶液（含柚皮苷2.8614 mg/mL、橙皮苷1.4561 mg/mL、新橙皮苷1.7028 mg/mL和黄芩苷8.2624 mg/mL）0.8、1.0、1.2 ml，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷的平均回收率分别为99.89%、96.32%、97.49%和99.13%，RSD分别为1.89%、1.78%、2.20%和2.71%。

表2 加样回收率试验结果

2.9 样品含量测定

取不同批次的枳芩颗粒，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷含量，结果见表3。

3 讨论

3.1 提取条件选择

本试验考察了水、95%乙醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇等不同提取溶剂，结果以甲醇提取4种成分较完全；在选择提取方法时，考察了回流和超声两种提取方法，发现这两种方法提取效果接近，但超声提取节约时间、操作简便，故选择超声提取法；在选择提取时间时，考察了30、40、50 min不同提取时间，确定30 min时4种成分已基本提取完全。

3.2 色谱条件选择

通过200～400 nm全波长扫描，发现柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷都在280 nm附近有最大吸收，而黄酮类成分一般都在280 nm处进行检测，故确定280 nm为检测波长；在选择流动相时，依次考察了乙腈-水、乙腈-磷酸水、甲醇-水，结果表明乙腈（A）-0.1%（B）磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，0～28 min，5%～26% A；28～36 min，26% A；36～48 min，26%～40% A；流速1 ml/min，检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 μl时柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷有较好的峰形，各峰间的分离度均大于1.5。故选择乙腈-0.1%磷酸水为流动相梯度洗脱。

枳芩颗粒具有清热泻火、消积解毒的功效，是在临床上应用较广的医院制剂。方中枳实为君药，黄芩为臣药，枳实中最主要的活性物质是橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷，黄芩中含量最高的活性成分是黄芩苷，故选择君药枳实、臣药黄芩中的主要成分作为枳芩颗粒的定量检测指标。这4种成分均是黄酮类成分，在 280 nm 附近有最大吸收，在同一色谱条件下能很好地分离。本研究同时测定柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷可为评价枳芩颗粒中活性成分提供一种可靠的分析方法，同时对于整体控制枳芩颗粒的质量提供理论依据。

本研究建立了HPLC法测定枳芩颗粒中黄酮类成分的含量方法，确定以甲醇为提取液，超声提取30 min ，色谱柱为 Kromasil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸水（梯度洗脱），流速1 ml/min，柱温30 ℃，检测波长280 nm。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷分别在0.194～3.876、0.110 ～ 2.192、0.129 ～ 2.574、0.453 ～ 9.050 μg/ml时与色谱峰面积线性关系良好，平均回收率在96.32%～99.89%之间，分离效果好、操作简便、重现性好、灵敏度高。

表3 枳芩颗粒中4种成分的含量