高产植酸酶乳酸菌及其黑豆酸面团发酵低植酸营养面包研究

曹伟超 罗 昆 程 新 陈 诚 郑建仙 黄卫宁 李 宁 FILIP Arnaut 周黎源

(1. 江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510641；3. 广州焙乐道食品有限公司，广东 广州 511400；4. 焙乐道食品集团，比利时 布鲁塞尔 1201；5. 山东稻香村食品工业有限公司，山东 菏泽 274000)

烘焙食品已成为世界主流食品[1]，其中面包是消费率最高的品类之一。然而，随着人们消费观念的不断提高，营养单一的小麦面包已无法满足人们的需求。近年来，黑豆因其合理的氨基酸组成模式及高蛋白优势而备受青睐[2]。但是，黑豆中含有多种抗营养因子，其中植酸的干物质含量可达(18.32±1.18) mg/g[3]，这些物质能与蛋白质、矿物质等多种营养成分结合，使得营养成分在人体消化过程中难以被吸收[4]。

现代烘焙行业中，酸面团常被作为一种天然的新型生物改良剂以赋予产品更高的感官品质及营养价值[5]。其中，探索微生物源的优化方法以便从自然界中获得具有特定功能作用的目标菌株是酸面团技术研究的前沿领域之一。Teixeira等[6]发现，具有α-半乳糖苷酶活力的短乳杆菌能有效降解多种意大利豆中的棉子糖；Coda等[7]应用植物乳杆菌发酵蚕豆基质以降低缩合单宁含量；Gualberto等[8-10]研究了通过添加微生物来源的植酸酶以达到降解植酸的目的，但是将定向筛选的高植酸酶活性乳酸菌直接应用于豆类酸面团体系的研究仍未见报道。

试验拟从豆类基质中筛选出具有高植酸酶活性的乳酸菌，并将其作为发酵剂制作黑豆酸面团面包；通过响应面设计确定黑豆酸面团的最佳发酵条件，探究发酵处理对黑豆蛋白及抗营养因子的影响，同时对黑豆酸面团面包的感官品质进行评估，旨在通过菌株筛选定向解决黑豆中的抗营养问题，为开发高蛋白、低植酸含量的营养面包及豆类酸面团技术的工业化应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

黑豆粉：山东呆豆家健康食坊；

高级面包粉：中粮鹏泰面业有限公司；

即发活性干酵母：乐斯福(明光)有限公司；

MRS肉汤培养基：杭州百思生物技术有限公司；

乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)L-19：高产植酸酶，筛选自自然发酵黑豆粉；

戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)K-12：不产植酸酶，筛选自自然发酵黑豆粉；

搅拌机：5K5SS型，美国Kitchen Aid公司；

醒发箱：SPC-40SP型，新麦机械(无锡)有限公司；

切片机：SM-302型，新麦机械(无锡)有限公司；

烤箱：SM-503型，新麦机械(无锡)有限公司；

实验室pH计：FE20型，梅特勒仪器(上海)有限公司；

恒温恒湿培养箱：SPX-150C型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；

紫外分光光度计：TU-1810型，北京普析通用仪器有限责任公司；

质构仪：CT3型，美国Brookfield公司。

1.2 试验方法

1.2.1 产植酸酶乳酸菌的初筛 从自然发酵豆粉(黑豆、红豆、蚕豆、鹰嘴豆)和传统酸面团中分离纯化出245株乳酸菌，取分离纯化后的乳酸菌悬浮液点接在改进后的植酸酶筛选培养基[11](含1%植酸钙)上，30 ℃培养48 h，观察并测量菌落及其周围透明水解圈大小，挑选出透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株接种于琼脂斜面培养基中，保存备用。

1.2.2 产植酸酶乳酸菌的复筛 参照GB/T 18634—2009并修改。将菌株接种至MRS肉汤中培养24 h，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液用于测定胞外酶活[12]。同时用无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.4)洗涤菌泥两次，然后悬浮于5 mL缓冲液中，450 W超声处理20 min(间隔5 s)，取破碎液用于测定胞内酶活。另取5 mL活化后的乳酸菌培养24 h，离心、洗涤后烘干至恒重并记录菌体重量[13]。取1.8 mL乙酸缓冲液(pH 5.5)于10 mL试管中，加入0.2 mL待测液(磷标准液，上清液，破碎液)后混匀，37 ℃水浴5 min，加入4 mL 5.0 mmol/L植酸钠溶液(pH 5.5)继续水浴30 min，最后加入4 mL终止液及显色液，摇匀，测定415 nm处吸光度。对照组先加入终止液及显色液再加入植酸钠溶液。以无机磷标准液的浓度为横坐标、吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3 产植酸酶乳酸菌菌落形态及菌株鉴定 将贮藏于冰箱中的菌株活化两代并划线分离至MRS固体平板，37 ℃ 培养48 h，观察菌落形态。进一步挑取单菌落涂布于载玻片上，革兰氏染色后通过光学显微镜进行镜检。以DNA原液为模板进行PCR扩增，引物为27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3')与1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，扩增片段通过琼脂糖凝胶电泳检测纯度及浓度后进行测序，并进行同源性分析。

1.2.4 黑豆酸面团发酵的单因素试验

(1) 菌悬液制备：将乳酸菌L-19在MRS液体培养基中活化至对数后期，6 000 r/min离心5 min，弃上清液，用无菌生理盐水洗涤两次并收集菌泥，将其制成浓度为107CFU/g 的菌悬液。

(2) 面团得率(DY)对植酸含量的影响：按每100 g酸面团计，接种9%菌悬液后调节初始pH至4.5，DY值分别为150，200，250，300，350，37 ℃培养24 h，考察DY值对酸面团中植酸含量的影响。

(3) 接种量对植酸含量的影响：按每100 g酸面团计，调节初始pH至4.5，DY值为250，分别接种3%，6%，9%，12%，15%菌悬液，37 ℃培养24 h，考察接种量对酸面团中植酸含量的影响。

(4) 发酵温度对植酸含量的影响：按每100 g酸面团计，接种9%菌悬液后调节初始pH至4.5，DY值为250，分别于23，30，37，44，51 ℃培养24 h，考察发酵温度对酸面团中植酸含量的影响。

(5) 初始pH值对植酸含量的影响：按每100 g酸面团计，DY值为250，接种9%菌悬液后分别调节初始pH至3，4，5，6，7，37 ℃培养24 h，考察初始pH对酸面团中植酸含量的影响。

1.2.5 Box-Behnken响应面试验 根据单因素试验结果，依据Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behenken试验设计原理，选取DY值、接种量、发酵温度作为自变量，以植酸含量为响应值进行三因素三水平的响应面分析试验，优化黑豆酸面团发酵工艺参数。

1.2.6 酸面团的制备 将高产植酸酶的乳酸片球菌L-19接至MRS液体培养基中，37 ℃培养24 h，6 000 r/min离心5 min，用无菌生理盐水洗涤两次得菌体。将获得的菌体悬浮于无菌水中并与黑豆粉混匀(根据最优条件，乳酸菌的初始接种量为8%、面团DY值为300)，37 ℃培养30 h，得酸面团。以不产植酸酶的乳酸菌K-12作为对照组。

1.2.7 酸面团发酵过程中pH、可滴定酸(TTA)及生长曲线的测定 取10 g黑豆酸面团样品与90 mL无菌水搅拌20 min，静置10 min，测其pH，采用0.1 mol/L NaOH滴定至pH 8.6，消耗的NaOH体积即为TTA[14]。称取10 g黑豆酸面团于90 mL无菌生理盐水中，梯度稀释后取100 μL混合液涂布于MRS固体培养基上，37 ℃培养36 h，观察并进行菌落计数[15]。

1.2.8 酸面团中抗营养因子含量的测定

(1) 植酸含量：参照Buddrick等[16-17]的方法并修改。称取0.5 g样品于50 mL离心管中，加入30 mL 0.5 mol/L 的HCl溶液，150 r/min震荡提取3 h，5 000 r/min 离心30 min，取1 mL上清液(空白组以1 mL HCl溶液代替)与2 mL NH4Fe(SO4)2溶液(0.02%)混匀，沸水浴30 min，迅速冰浴冷却，6 000 r/min离心30 min,取2 mL 上清液与3 mL 1%双吡啶混匀进行颜色反应，测定519 nm处吸光度。此外，将植酸标准样品溶解于HCl中，分别配制浓度为0.00，0.04，0.08，0.12，0.16，0.20 mg/L的植酸溶液，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

(2) 棉子糖含量：称取10 g酸面团样品，预先使用石油醚回流除去脂肪，按料液比(m酸面团∶V乙醇)1∶10 (g/mL) 加入80%乙醇并于80 ℃回流1 h，抽滤，收集滤液，滤渣中加入100 mL水并搅拌1 h后重新抽滤，再次收集滤液。使用10%醋酸铅沉淀蛋白并离心(11 000 r/min，20 min)，重复多次使蛋白质除尽，用草酸去除铅元素。滤液经真空浓缩至100 mL，采用HPLC进行分析。色谱条件为[18]：色谱柱为Bridge BEH Amide(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以V乙腈∶V水为70∶30的混合液作为流动相；柱温35 ℃；流速1.0 mL/min；进样量20 μL；示差折光检测器；检测池温度35 ℃。

(3) 单宁含量：准确称取1.0 g样品与10 mL试剂I(V盐酸∶V甲醇为1∶100)震荡2.5 h，4 000 r/min离心20 min，保留上清液。采用香草醛法[7]测定样品中缩合单宁含量。以儿茶素作为标样绘制标准曲线，测定结果以儿茶素当量表示。

1.2.9 酸面团中多肽分子量分布 称取1.0 g样品于烧杯中并加入50 mL流动相，120 r/min震荡30 min，10 000 r/min 离心20 min，取上清液并过膜处理，进行HPLC分析。色谱条件[19]：色谱柱为体积排阻色谱柱TSKge12000SWXL(300 mm×7.8 mm)；以V乙腈∶V水∶V三氟乙酸为45.0∶55.0∶0.1的混合液作为流动相；紫外检测波长220 nm；流速0.5 mL/min；柱温30 ℃。

1.2.10 面包感官评定 参照杨文丹等[20]的方法制作面包，黑豆粉在面粉中的替代比例为15%。采用9分嗜好法进行感官评定，由20位经过培训的人员(10女10男)对面包外观、内部结构、柔软度、口感以及整体可接受度进行评分。

1.3 数据处理

采用Excel 2013和Origin 8.5软件进行数据处理及图表绘制，通过SPSS 16.0软件进行显著性和方差分析(ANOVA)，显著性水平为P<0.05。

2 结果与讨论

2.1 产植酸酶乳酸菌的镜检形态及菌株鉴定

从自然发酵的豆粉(黑豆、红豆、蚕豆、鹰嘴豆)以及传统酸面团中分离纯化出245株乳酸菌，经初筛后得到具有植酸钙水解能力的乳酸菌共7株(见图1)，相应的透明圈与菌落直径比见表1。通过测定植酸酶活性进一步复筛(表2)，仅3株乳酸菌K-22、L-4、L-19表现出较高的植酸酶活性，其中L-19菌株的植酸酶活性最高，其胞外酶与胞内酶活性分别为1.36，0.30 U/mL，与Karaman等[4]的数百株乳酸菌及酵母菌相比，该菌株的植酸酶活性更高，表明L-19具备高产植酸酶特点。胞外植酸酶可与面团中的植酸直接接触，更利于植酸的降解[21]。

图1 L-19 植酸钙水解圈

表1 乳酸菌的透明圈与菌落直径比†

表2 乳酸菌的植酸酶酶活比较†

鉴于L-19的植酸酶活力最高，因此将其作为目标菌株进行后续试验。L-19在MRS固体平板上呈乳白色扁平圆形，其边缘整齐、表面平滑且带有光感(见图2)，具有典型的乳酸菌菌落特征。此外，同源性比对结果(图3)表明该菌株L-19为乳酸片球菌，登录号为KJ580428.1。

图2 L-19菌落形态及镜检

2.2 单因素试验

由图4可知，提高面团的DY值能够显著降低植酸含量。这是因为较高的水分有利于菌株的生长代谢与相应酶的合成[22]。酸面团中的植酸含量随接种量及发酵温度的提高先减少后增加，当接种量为9%，发酵温度为37～44 ℃时，更有利于植酸的降解。这可能是由于低接种量无法使目标菌株成为优势菌群，而过高的接种量会导致体系过度酸化，抑制植酸酶的活性[23]。此外，发酵温度也是影响乳酸菌生长代谢及酶活的重要因素，但试验得出的最适温度与Humer等[24]的研究结果有所差异。初始pH值对植酸降解水平没有显著影响。

2.3 响应面分析

2.3.1 拟合模型的建立及显著性检验 在单因素试验基础上，选用响应面法对黑豆酸面团发酵工艺条件进行优化。利用Design-Expert 8.0.6软件的Box-Behenken试验设计，以DY值、接种量、发酵温度为响应变量，以植酸含量为响应值进行数据拟合。响应面试验因素水平编码表见表3，Box-Behnken试验设计及结果见表4。

对表4进行多元回归拟合，得到多元回归方程：

Y=3.47+0.17A+0.049B+0.31C+0.22AB+0.44AC+0.12BC+0.78A2+0.36B2+0.46C2。

(1)

图3 高产植酸酶乳酸菌系统发育树

图4 各因素对黑豆酸面团植酸含量的影响

表3 因素水平编码表

表4 Box-Behnken试验设计及结果

表5 回归模型的方差分析及显著性检验†

2.3.2 响应面分析 由图5可知，面团得率(DY)与接种量的响应面倾斜度最大，表明两者对植酸含量的影响更加显著。而发酵温度与面团得率(DY)对应的等高线更偏向于呈椭圆形，说明两者间的交互作用最为强烈。相反，接种量与发酵温度间的交互效应最弱，其对植酸含量的影响程度也最小。

图5 各因素交互作用对植酸含量的影响

2.3.3 实验验证 由Design-Expert 8.0.6软件得出黑豆酸面团的最佳发酵条件为DY值299.17、发酵温度36.93 ℃、接种量8.04%，此时植酸含量为3.415 mg/g。考虑到实际操作的可行性，将最佳发酵工艺调整为：DY值300、发酵温度37 ℃、接种量8%。在此条件下进行3次验证实验，所得黑豆酸面团中植酸含量为3.424 mg/g与理论值相近，说明采用响应面设计得到的工艺参数真实可信，具有指导意义。

2.4 黑豆酸面团发酵过程中的菌株生长曲线比较

由图6可知，两株乳酸菌的初始菌落总数均为7.1 lg(CFU/g) 左右，相比于无停滞期的K-12，L-19经过短暂停滞期后进入对数增长期，说明K-12对黑豆基质的适应能力较强。而进入稳定期后，L-19的菌落总数[8.7 lg(CFU/g)]略高于K-12的[8.5 lg(CFU/g)]，说明L-19在发酵后期更加适应黑豆酸面团体系。Hammes等[25]认为发酵过程中酸面团体系内的微生物群体将趋于相对稳定状态，其中乳酸菌的菌落总数约为8～9 lg(CFU/g)，与试验结果一致。

图6 黑豆酸面团发酵过程中菌株生长曲线

2.5 黑豆酸面团发酵过程中pH和TTA的变化

由图7可知，乳酸片球菌L-19的产酸能力稍强于K-12，且两者的酸化趋势无明显差异。发酵初期，黑豆酸面团体系的酸化速度较为缓慢，直至第5 h后pH出现跃变并最终稳定在4.1左右。pH的降低是乳酸菌在生长过程中合成多种有机酸的作用结果[26]，与试验中的酸化曲线大体相符。此外，酸化现象被视为酸面团发酵过程中最重要的技术特征之一，适宜的酸化有利于改善面包品质。Buddrick等[16]认为酸面团体系的最适pH为3.5～4.3，与试验中面团的酸化程度相近，表明两株乳酸菌具备可应用性。

2.6 黑豆酸面团发酵前后的抗营养因子含量

由表6可知，乳酸菌发酵能够有效降解体系中的抗营养因子，相比于发酵前的植酸含量，采用L-19、K-12发酵的黑豆酸面团其植酸含量分别降低了62.70%，37.84%，说明L-19对植酸的降解作用更强，该降解率也优于Karaman等[4，27-28]的研究结果，这进一步表明L-19具备高产植酸酶的特性。棉子糖、缩合单宁含量经L-19发酵后分别降低了35.29%，25.61%，但与植酸降解率相比仍有较大差距，说明乳酸片球菌L-19具有特定降解植酸的功能作用。抗营养因子的降解主要源于酸性环境下激活的植酸酶及菌株生长代谢过程中合成的微生物酶[29]。

图7 黑豆酸面团发酵过程中pH和TTA的变化

表6 黑豆酸面团发酵前后的抗营养因子含量†

2.7 黑豆酸面团中的多肽分子量分布

研究酸面团发酵过程中黑豆蛋白经酶解释放的具有生物学功能多肽[30]分子量变化具有重要意义。由表7可知，黑豆酸面团中的多肽分为8种不同的分子量水平，其中分子量处于50～2 000 Da的小分子活性肽在两种酸面团中分别占51.47%，45.07%，这是因为乳酸片球菌L-19产生的植酸酶降低了黑豆基质中的植酸含量，从而避免了体系中的其他蛋白酶系与其发生非特异性结合而失活[31]，使黑豆蛋白水解程度得到了提升，因此乳酸片球菌L-19有助于改善黑豆酸面团面包的营养特性。

2.8 面包产品的感官评定

由图8可知，两种酸面团面包的整体可接受度较高，L-19黑豆酸面团面包的品质(7.8)优于对照组K-12(7.4)，而未经发酵的黑豆面包最不易被接受。研究[32]表明，酸面团技术对外加豆类蛋白面包的品质具有改善作用，与试验结果相似。其中植酸含量的降低是改善面包品质的重要因素之一，是由于植酸干扰面团面筋网络的形成[33]，从而影响面包品质。

表7 发酵后黑豆酸面团中的多肽分子量分布

图8 面包感官评定

3 结论

研究表明，试验筛选的乳酸片球菌L-19具有高产植酸酶的功能特性，利用该菌株作为发酵剂制作的黑豆酸面团有利于改善面包的营养及感官品质。黑豆基质中，乳酸片球菌L-19生长良好、酸化程度适当。经发酵后，黑豆中的多种抗营养因子得到有效降解，其中植酸的降解程度尤为显著。此外，乳酸片球菌L-19有助于黑豆蛋白水解以释放出小分子活性肽。感官方面，黑豆酸面团面包L-19的整体可接受度最高，具有良好的烘焙特性。植酸的降解率仅是反映面包营养价值改善的其中一个指标，试验并未涉及其他相关营养指标的评价，有待进一步探究。