烟草中淀粉降解菌的筛选、鉴定及发酵工艺优化

张晓瑞 刘晓晖 付 博 杨宗灿 时向东

(1. 河南农业大学烟草学院，河南 郑州 450000；2. 深圳烟草工业有限责任公司，广东 深圳 518000；3. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南 郑州 450000)

淀粉是烟叶中重要的有机化合物，其含量过高会产生焦糊气味以及多种有害成分，对烟草制品的感官质量产生不良影响[1-3]。相较于国外优质烟叶，中国烟叶淀粉含量普遍偏高。研究[4]表明，一定范围内，烟叶感官质量随淀粉含量的下降而提升。因此利用适宜的方法降解烟叶淀粉对提升烟叶品质具有重要意义[5]。

大量研究[6-7]表明，微生物法降解烟叶淀粉可显著提升烟叶品质。胥海东[8]利用枯草芽孢杆菌对烟叶进行发酵，烟叶淀粉降解率达11.49%，烟叶内在品质得到改善；陈雨峰等[9]发现，烟叶经不同浓度芽孢杆菌菌液发酵后，烟叶淀粉含量显著降低，糖含量和香气量增加，烟叶品质显著提升。微生物法在降解烟叶淀粉方面应用广泛，但仍存在烟叶淀粉降解率偏低，效果不稳定、烟用微生物工业应用技术缺乏等问题。烟叶发酵过程中，提高产淀粉酶菌株的酶活可提高烟叶淀粉的降解率[10]，而目前研究多集中于利用诱变、转基因以及选育优良菌株等技术提高菌株酶活性以改善烟叶发酵效果，其操作方式复杂且周期较长[11-13]。相对而言，通过产酶培养基优化和发酵工艺优化相结合的方法，不仅能在较短时间内提高菌株酶活及烟叶淀粉降解率，而且能够稳定工业应用效果。

文章拟从烟叶表面筛选出本源微生物，通过响应面试验优化菌株产酶条件，利用正交试验优化烟叶发酵工艺，旨在通过微生物发酵定向解决烟叶淀粉问题，为提升烟叶品质及烟用微生物的工业应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟叶：2019年河南许昌襄县B2F初烤烟叶；

淀粉培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏5.0 g、NaCl 5.0 g、可溶性淀粉20.0 g、琼脂粉15.0 g，水1 000 mL，pH 7.0；

LB培养基：酵母粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、水1 000 mL，pH 7.0；

LB固体培养基：酵母粉5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、琼脂粉15 g、水1 000 mL，pH 7.0；

发酵培养基：可溶性淀粉10.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 3.0 g、水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 试验方法

1.2.1 产淀粉酶菌株的筛选

(1) 初筛：参照桑筱筱等[14]的方法并修改，将10 g烟叶置于150 mL灭菌蒸馏水中，35 ℃、160 r/min培养24 h，按10-3，10-4，10-5倍稀释涂布于LB固体培养基，35 ℃培养24 h。挑取单菌落至淀粉培养基，培养24 h，滴加碘液，观察透明圈产生情况，测定各菌株的透明圈直径/菌落直径(D/d值)。

(2) 复筛：将D/d值较大的菌株接种至LB液体培养基，35 ℃、160 r/min培养24 h，将种子液按1%接种量接种于发酵培养基，摇瓶培养，4 ℃、4 000 r/min离心20 min。用pH 7.0的KH2PO4—NaOH缓冲液洗涤菌体沉淀(1 000 mL发酵液菌体中加入100 mL缓冲液)，超声波破碎40 min(20 W，间隔4 s，超声2 s)，4 ℃、8 000 r/min 离心20 min，测定上清液(粗酶液)[15]的淀粉酶活力。

(3) 淀粉酶活力测定：以45 ℃、pH 5条件下，1.0 mL菌株粗酶液每分钟催化分解淀粉生成1 mg麦芽糖所需酶量定义为1个酶活力单位。

1.2.2 菌株形态观察及分子鉴定

(1) 形态观察：将HX-6菌株接种至LB固体培养基，35 ℃培养24 h，观察菌落形态特征并对菌株进行革兰氏染色。

(2) 分子生物学鉴定：依据细菌基因组DNA试剂盒提取HX-6菌株基因组DNA。以菌株HX-6的基因组DNA为模板，利用引物gyrA-F(5′-CAGTGTTTGATCCTGGCT-3′)和gyrA-R(5′-AGGAGCTGATCCAGCCGCA-3′)扩增gyrA序列。经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将gyrA阳性克隆条带的PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测定结果利用BLAST比对分析，并用MEGA6.0软件邻接法构建系统发育树，明确菌株HX-6的分类地位。

1.2.3 HX-6菌株产酶培养基优化

(1) 碳源种类及质量浓度对菌株淀粉酶活力的影响：发酵培养基中分别以10 g/L的可溶性淀粉、红薯淀粉、葡萄糖、可溶性淀粉与红薯淀粉混合粉(m可溶性淀粉∶m红薯淀粉为1∶1)作为碳源，其他条件不变，测定淀粉酶活力，确定最适碳源。调整最适碳源质量浓度为5，10，15，20，25 g/L，考察碳源最适质量浓度对菌株淀粉酶活力的影响。

(2) 氮源种类及质量浓度对菌株淀粉酶活力的影响：以质量浓度为10 g/L的蛋白胨、NH4NO3、酵母粉、蛋白胨与酵母粉混合粉(m蛋白胨∶m酵母粉为1∶1)作为氮源，其他条件不变，测定淀粉酶活力，确定最适氮源。调整最适氮源质量浓度分别为5，10，15，20，25 g/L，考察最适氮源质量浓度对菌株淀粉酶活力的影响。

(3) 无机盐种类及质量浓度对菌株淀粉酶活力影响：分别添加质量浓度为3 g/L的NaCl、CaCl2、KNO3、MgSO4作为无机盐，其他条件不变，测定淀粉酶活力，确定最适无机盐。调整最适无机盐的质量浓度分别为1，3，5，7，9 g/L，考察最适无机盐的质量浓度对菌株淀粉酶活力的影响。

(4) 响应面优化：依据单因素试验结果，以最适碳源、氮源、无机盐为自变量，采用Design Expert 11软件对培养基成分进行Box-Behnken响应面试验优化。

1.2.4 烟叶发酵工艺优化 参照谷月[16]的方法并修改，烟叶经回潮、切丝后制得试验用长度均匀的烟丝。将产酶优化后菌株HX-6的粗酶液均匀喷施于烟丝表面，以烟丝表面喷施同等比例KH2PO4—NaOH缓冲液为对照，无菌水调整烟叶含水率至18%，于恒温恒湿箱中进行发酵。发酵后烟丝于80 ℃烘箱中干燥5 min，对菌株粗酶液进行灭活。

(1) 发酵时间对烟叶淀粉质量分数的影响：将粗酶液按烟丝重量3%的比例均匀喷施于烟丝表面，33 ℃分别发酵8，16，24，32，40，48 h后测定烟叶淀粉质量分数。

(2) 粗酶液添加量对烟叶淀粉质量分数的影响：将粗酶液分别按烟丝重量1%，3%，5%，7%的比例均匀喷施于烟丝表面，33 ℃发酵24 h后测定烟叶淀粉质量分数。

(3) 发酵温度对烟叶淀粉质量分数的影响：将粗酶液按烟丝重量3%的比例均匀喷施于烟丝表面，分别于23，28，33，38，43 ℃发酵24 h后测定烟叶淀粉质量分数。

(4) 正交优化：在单因素试验基础上，以烟叶淀粉质量分数为指标，考察发酵时间、粗酶液添加量、发酵温度对烟叶淀粉的降解效果，设计三因素三水平正交试验，优化发酵工艺。

1.2.5 常规化学成分的测定

(1) 水溶性总糖及还原糖：按YC/T 159—2002执行。

(2) 总植物碱：按YC/T 160—2002执行。

(3) 总氮：按YC/T 161—2002执行。

(4) 淀粉：按YC/T 216—2013执行。

1.2.6 感官评价 发酵烟丝卷制成卷烟，于(22±1) ℃、相对湿度(60±2)%下平衡水分48 h。由河南中烟工业有限责任公司技术中心组织评吸专家从卷制样品的香气质(A)、香气量(B)、浓度(C)、柔细度(D)、余味(E)、杂气(F)及刺激性(G)7个方面进行感官质量评价。感官评价总分=(A+B)×2.3+C×1.5+D+E+F+G。

1.2.7 数据处理 各试验指标均重复3次，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，Origin 2019软件绘图。

2 结果与分析

2.1 烟叶中产淀粉酶菌株的分离与筛选

经初步筛选产生透明圈的菌株共有53株，其中D/d值>1.5的菌株10株(见图1)。由表1可知，菌株HX-6的D/d值最大，初步判断HX-6菌株淀粉酶活力最高。

图1 产淀粉酶菌株的透明圈及生长情况

表1 10株淀粉酶产生菌菌株的透明圈直径与菌落直径

由图2可知，菌株HX-6的淀粉酶酶活最大，为38.96 U/mL，因此选择HX-6为试验菌株。赵淑琴等[17]从富含淀粉的土壤中筛选出初始酶活为32.5 U/mL高产淀粉酶菌株；聂晶晶等[18]从烟叶表面筛选出一株高效降淀粉的解淀粉芽孢杆菌，其酶活为25.2 U/mL，均低于菌株HX-6的酶活。

2.2 菌株HX-6的形态与分子学鉴定

由图3可知，HX-6菌落呈乳白色，不透明，边缘不规则，直径约4 mm，经革兰氏染色为阳性菌，细胞形态呈杆状。

GyrA序列分析结果表明，菌株HX-6与枯草芽孢杆菌的同源性达99%；采用邻接法构建菌株HX-6及其相似菌株的系统发育树，结果表明HX-6菌株与枯草芽孢杆菌SRCM101393亲缘关系最近(图4)。综合形态特征和gyrA序列分析结果，菌株HX-6为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

2.3 HX-6菌株产酶培养基优化

2.3.1 单一碳源、氮源、无机盐对酶活的影响 由图5(a)可知，碳源种类对菌株产淀粉酶影响显著(P<0.05)，相较于单一碳源，可溶性淀粉与红薯淀粉(m可溶性淀粉∶m红薯淀粉为1∶1)混合作为碳源时，HX-6菌株淀粉酶活性最高，可能是由于混合培养基中淀粉含量较高，菌株产生的淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖，菌体能利用产生的葡萄糖进行增殖，且红薯淀粉中含有多种矿质元素和维生素，这些营养物质促使菌体量不断增加，提高了淀粉酶产量[19]，与代阳等[20]的结果一致。

图2 10株淀粉酶产生菌的淀粉酶活力

图3 菌落形态特点

图4 HX-6菌株系统发育树

字母不同表示差异显著(P<0.05)

由图5(b)可知，无机氮——硝酸铵作为氮源时，菌株HX-6酶活性最低；而有机氮源作为氮源时的产酶效果明显优于无机氮源，这是因为有机氮源含有丰富的氨基酸、维生素及生长因子等营养物质，其中氨基酸可直接参与微生物体内的转氨或脱氨作用，维生素可作为一些酶的辅因子参与胞内生命活动，提高菌株产酶效果[21]。相较于单一有机氮源，蛋白胨与酵母粉(m蛋白胨∶m酵母粉为1∶1)混合作为氮源时，HX-6菌株酶活力最高，这是由于酵母粉分子比蛋白胨分子小，更易被菌体吸收，促进菌体生长，蛋白胨则利于菌体稳定期的延长，促进菌体代谢及产酶，共同使用时增强了菌株的产酶作用[22-24]。

由图5(c)可知，以KNO3作为无机盐时，HX-6菌株淀粉酶活力显著高于其他处理，其次是MgSO4、CaCl2、NaCl，表明KNO3能显著提高枯草芽孢杆菌HX-6的酶活，这是由于K+能提高酶的结构稳定性，提高酶活性[25]，与丁翠珍等[26]的结果一致。

2.3.2 碳源、氮源、无机盐质量浓度对酶活的影响 由图6 可知，随着碳源(m可溶性淀粉∶m红薯淀粉为1∶1)质量浓度的增加，酶活先升高后降低，当碳源质量浓度为15 g/L时，酶活最高。当氮源(m蛋白胨∶m酵母粉为1∶1)质量浓度为20 g/L时，酶活最高；随着氮源质量浓度的增加，酶活显著降低，可能是混合氮源浓度过高使培养基渗透压增加，细胞脱水或死亡，抑制了酶的表达。当KNO3质量浓度为3 g/L时，酶活最高。

2.3.3 Box-Behnken设计与结果 在单因素试验基础上，以碳源(m可溶性淀粉∶m红薯淀粉为1∶1)质量浓度、氮源(m蛋白胨∶m酵母粉为1∶1)质量浓度、KNO3质量浓度为自变量，根据Box-Behnken中心组合原理设计三因素三水平响应面试验优化产酶培养基。试验因素水平表见表2，试验设计与结果见表3。

由软件可得各因素对菌株产淀粉酶酶活(Y)的多元回归方程为：

Y=66.18+3.00A+4.83B-0.4450C-1.36AB+1.8AC+1.53BC-9.34A2-2.32B2-3.32C2。

(1)

由表4可知，模型P=0.000 8<0.01，表明该数学模型选择恰当；失拟项P=0.056 8>0.05，说明试验无失拟项因素存在，进一步说明模型拟合度良好。决定系数R2=0.951 1，表明有95.11%的试验数据可用此模型进行解释，真实值与预测值之间具有较好的拟合度和可靠度，该方案可行。由F值判断，各因素对淀粉酶活的影响顺序为B>A>C；A、B、A2对菌株酶活影响极显著(P<0.01)，C2对菌株酶活影响显著(P<0.05)。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

表2 Box-Behnken试验设计因素水平

表3 响应面试验设计与结果

表4 回归模型方差分析†

2.3.4 响应曲面分析 由图7可知，碳源质量浓度与氮源质量浓度、碳源质量浓度与KNO3质量浓度之间的交互作用影响显著，氮源质量浓度与KNO3质量浓度之间的交互作用影响较小。同时影响酶活最显著的因素是氮源质量浓度，表现为其响应面弧度变化最大，其次是碳源质量浓度和KNO3质量浓度。

2.3.5 发酵最佳培养基确定及验证 应用Design-Expert软件得到产酶培养基的最佳配方为碳源(m可溶性淀粉∶m红薯淀粉为1∶1)质量浓度17.0 g/L，氮源(m蛋白胨∶m酵母粉为1∶1)质量浓度21.89 g/L，KNO3质量浓度2.58 g/L，预测酶活为66.23 U/mL。经3次实验验证，得到酶活平均值为(66.82±0.65) U/mL，与理论值基本吻合，说明该回归方程能比较真实地反映各因素对菌株酶活的影响，且酶活优于王越[27]的。

2.4 烟叶发酵工艺优化

2.4.1 发酵条件对烟叶淀粉质量分数的影响 由图8可知，与对照组相比，烟叶经粗酶液发酵后淀粉质量分数显著下降，发酵32 h时，烟叶淀粉质量分数由最初的4.85%下降至3.53%，降幅达27.21%。当粗酶液添加量为5%时，烟叶淀粉质量分数下降幅度最大，达27.63%，当粗酶液添加量>5%时，淀粉质量分数变化趋势平缓，主要是随着粗酶液添加量的增加，酶与底物反应越彻底完全，当粗酶液添加量达到一定值时，酶分子之间互相竞争加剧，过量的酶分子无法与底物接触，烟叶淀粉降解效果降低。当发酵温度为28～43 ℃时，烟叶淀粉质量分数显著降低，温度为33 ℃时烟叶淀粉质量分数最低，此时淀粉降解率为17.01%；当温度超过38 ℃时，由于发酵温度过高，菌株酶活性下降，烟叶淀粉降解效果降低。

图7 各因素交互作用对酶活的影响

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4.2 正交试验 以烟叶淀粉质量分数为指标，根据单因素试验结果设计正交试验，试验因素水平表见表5，结果与分析见表6。

表5 正交试验因素水平表

表6 正交试验结果与分析

由表6可知，烟叶最佳发酵组合为A1B1C3，即发酵时间27 h、菌株粗酶液添加量4%、发酵温度35 ℃。对最佳发酵组合进行实验验证(n=3)，发酵后烟叶淀粉质量分数为3.31%，相较于原烟(淀粉质量分数为4.85%)淀粉降解率达31.75%，且高于胥海东[8](11.49%)和冯颖杰等[28](29.84%)的。

2.4.3 最佳发酵工艺条件下烟叶常规化学成分及感官质量变化 由表7可知，烟叶经粗酶液发酵后，总糖、还原糖质量分数分别增加了18.8%，20.2%；总氮和烟碱质量分数显著降低，两糖差显著降低。杜咏梅等[29]研究表明，提高还原糖相对于总糖的质量分数、减少两糖差值，有利于提高烟叶吃味品质。

由表8可知，发酵后烟叶感官质量显著提升，香气量增加、香气质提升、杂气减轻、刺激性降低。这是由于微生物发酵将烟叶淀粉转化为可溶性糖，增加了烟叶中的潜香类物质，减少了烟叶的杂气来源，从而提升了烟叶的工业可用性[30]；且还原糖等烟叶香气前体物质对感官评价影响显著，烟叶香气特性与还原糖呈极显著正相关[31-32]。

表7 最佳发酵工艺下烟叶常规化学成分†

表8 最佳发酵工艺下烟叶感官质量†

3 结论

试验筛选的枯草芽孢杆菌HX-6具有高效降解烟叶淀粉的功能特性，经最佳产酶培养基优化后菌株HX-6淀粉酶活达66.82 U/mL，较初始培养条件下的酶活提高了71.51%。烟叶经菌株HX-6粗酶液发酵后，淀粉降解率达31.75%，烟叶的总糖和还原糖含量显著增加。发酵处理后的烟叶感官品质显著提升，香气量增加、香气质提升、杂气减轻，工业可用性增加。后续将重点研究生产线酶制剂施用技术及烟叶发酵控制技术，为工业化应用提供技术支撑。