大豆11S/7S球蛋白比值QTL定位及相关基因分析

武小霞，崔一凡，谢建国，赵雅彬，李佳鹏，井红钰，赵 莹

（东北农业大学农学院，哈尔滨 150030）

大豆（Glycine maxL.Merr.）是世界重要粮油作物，也是人类摄入植物蛋白质主要来源。贮藏、结构和防御相关的三类蛋白是大豆中蛋白存在主要形式，其中贮藏类蛋白在大豆蛋白中约占70%[1]。按照蛋白质沉降系数为分类标准，可将大豆中蛋白质分为4个组分，即2S、7S、11S和15S组分，其中7S与11S球蛋白含量最丰富[2]。7S与11S球蛋白在加工特性与营养品质方面具有显著差异，因此，两者也共同决定大豆蛋白制品功能特性以及营养价值[3]。种子中7S和11S球蛋白含量差异影响大豆营养品质及加工特性。

7S球蛋白由多种蛋白共同组成，其最主要成分为β-伴大豆球蛋白，另外还包括碱性7S球蛋白以及γ-伴大豆球蛋白，由α'、α和β亚基组成[4]。7S球蛋白可用于降低肥胖症患者内脏脂肪及血脂血糖[5]。11S球蛋白主要由酸性亚基A和碱性亚基B组成，其中酸性亚基有增强胰岛素功能[6]。11S球蛋白含硫氨基酸含量较高，是7S球蛋白含硫氨基酸含量5～6倍[7]。Kita等发现11S球蛋白中氨基酸含量显著高于7S球蛋白[8]。这与Coates等发现β-伴大豆球蛋白β-亚基无含硫氨基酸显著降低，导致7S球蛋白中氨基酸含量降低一致[9]。

QTL定位利用分子标记与基因连锁关系控制数量性状基因，是挖掘功能基因主要方法，目前关于大豆11S/7S球蛋白研究多为利用种质资源群体分析11S/7S球蛋白比值对大豆加工特性的影响。与QTL定位相关大豆蛋白研究大部分基于蛋白质含量。目前国内外已开展大量有关大豆蛋白含量及组分QTL定位研究[10-11]，对于蛋白中11S/7S球蛋白比值相关QTL定位及相关基因分析研究较少。本研究以野生大豆ZYD00006为供体，以栽培大豆绥农14为轮回亲本构建全基因组导入系，对大豆11S/7S球蛋白比值作QTL定位并分析候选基因，为大豆分子辅助育种提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 植物材料与种植方法

本研究将野生大豆ZYD00006作为供体亲本，经杂交与回交导入轮回亲本栽培大豆绥农14中，构建一个野生大豆全基因组导入系群体。于2018年及2019年将该群体种植于黑龙江省哈尔滨市香坊区东北农业大学实验实习与示范向阳基地（北纬45°450 N，东经126°380 E）。每行80株，行长与株距分别为5 m和0.06 m，按区收获并脱粒，籽粒留作后期分析使用。

1.2 11S/7S球蛋白比值测量

2018年、2019年导入系植株各181份材料，每份材料随机取100粒磨成豆粉，称量0.1 g，加入1 mL提取缓冲液（10%NaCL溶液）65℃水浴40 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液，与Loading Buffer 2∶1混合备用。参考姜振峰等方法[12]。采用浓度10%分离胶和5%浓缩胶测定7S与11S球蛋白各亚基含量。SDS-PAGE电泳后，置于考马斯亮蓝G-250中染色2 h，反复脱色至胶条上条带清晰可见。凝胶脱色后扫描仪扫描，用Quantity one（4.6.2）分析凝胶照片，计算11S/7S球蛋白比值。

1.3 统计与分析

利用SPSS 17.0软件对两年内大豆11S/7S球蛋白比值作统计分析。所用分子标记信息参照文献[13]，QTL分析采用ICIMapping 4.1中“CSL”模块，采用完备区间作图法和单标记分析法检测QTL。若似然函数比值对数值（Logarithm of odds，LOD）≥2则认为QTL存在，QTL最终命名采用q+性状名称+LG或LG编号+“-”+QTL编号方式[14]。

1.4 基因注释

将目标区间内基因比对到GO数据库（https://www.ebi.ac.uk/QuickGO/）与KEGG数据库（https://www.KEGG.jp/）作基因注释。采用信息学分析方法，将同源基因信息、显著富集的代谢通路信息、编码蛋白信息整合，预测区间内候选基因功能，初步筛选与11S/7S球蛋白比值性状相关候选基因。

1.5 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

以轮回亲本绥农14为对照，以90%分位数和10%分位数分别作为筛选高低表型极端材料阈值，低于10%分位数11S/7S球蛋白比值材料作为低表型极端备选材料，高于90%分位数11S/7S球蛋白比值材料作为高表型极端备选材料，将两年得到各极端备选材料取交集得到实时定量材料。

Trizol法提取种子RNA，反转录试剂盒（Vazyme）反转录成cDNA。为确定候选基因在不同材料中转录水平，使用LightCycler480系统和Primer 5软件设计引物作qRT-PCR分析。通过Primer 5软件设计6个候选基因特异性引物，内参基因为GmActin4（GenBank No：AF049106），引物序列见表1。退火温度范围为55.8～59.1℃，试验温度为57℃。候选基因转录水平根据2-ΔΔct计算。为保证试验准确性和可靠性，每个样品3次重复。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers of qRT-PCR

2 结果与分析

2.1 CSSL群体两年表型数据分析

2018以及2019年CSSL群体11S/7S球蛋白比值表型数据统计情况见表2。两年间CSSL群体11S/7S球蛋白比值差异较大，范围为0.22～5.90。2018年群体11S/7S球蛋白比值平均值为1.52，标准差为0.66，峰度为1.72，偏度为1.33。2019年群体11S/7S球蛋白比值平均值为2.23，标准差为1.23，峰度为0.19，偏度为0.85。CSSL群体底荚高度呈近似正态分布，适用于QTL定位（见图1）。

2.2 大豆11S/7S球蛋白比值性状QTL分析

利用单标记分析，在J连锁群上定位到1个QTL，该位点位于16号染色体上，起始位置为1 046 637 bp，终止于1 170 661 bp，全长124 024 bp，命名为q11S/7S-J-16。加性效应为0.3299，表型贡献率为6.49%。

利用完备区间作图法，在3个连锁群上发现3个大豆11S/7S球蛋白QTL（见表3）。其中，在J连锁群上定位到QTL与单标记分析检测到QTL位置相同（见图2）。

表2 两年CSSL群体11S/7S球蛋白比值表型数据参数Table 2 Phenotypic data parameters of 11S/7S globulin ratio of CSSL population in two years

图1 CSSL群体11S/7S球蛋白比值表型数据频率分布Fig.1 Frequency distribution of phenotypic data of 11S/7S globulin ratio in CSSL population

表3 ICIM法对大豆11S/7S球蛋白比值相关QTL分析Table 3 Analysis of QTL related to soybean 11S/7S globulin ratio by ICIM

图2 CSSL群体11S/7S球蛋白比值QTL在连锁群上分布Fig.2 Distribution of QTLs for 11S/7S globulin ratio in CSSL population on linkage group

由表3可知，所有QTL表型贡献率最大值为6.10%，最小值为4.93%，LOD在2.00～2.49内浮动。通过2018年数据检测到一个QTL位点q11S/7S-K-1，表型贡献率为4.93%，加性效应为0.4016。2018年数据检测到一个QTL位点q11S/7SO-1，该位点表型贡献率最大为6.10%，加性效应为0.3222。2019年检测到q11S/7S-J-1表型贡献率为5.08%，加性效应为0.9879。所有加性效应均为正值，说明控制大豆11S/7S球蛋白有利基因来自于绥农14。

2.3 QTL区间基因注释

对QTL区间作基因注释，共得到46个候选基因（见表4）。参考Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）网站基因时空表达量数据，结合基因注释信息分析方法，筛选出与蛋白性状相关候选基因6个。其中，Glyma.09G014400被描述为功能性抑制剂、脂质转移蛋白、种子存储2S蛋白白蛋白超家族蛋白，疏水种子蛋白。Glyma.09G014700被描述为ADP-核糖基化因子GTP酶激活蛋白AGD11相关，Ca2+依赖性磷脂结合蛋白。Glyma.09G015100被描述为磷脂酰肌醇转移蛋白SEC14和相关蛋白。Glyma.16G034700被注释为与任何蛋白质或蛋白质复合物。Glyma.16G036200被注释为60S核糖体蛋白L7，大亚基核糖体蛋白L7e。Glyma.16G036300被注释为阳离子相关的阳离子氨基酸转运蛋白，氨基酸转运蛋白。

2.4 候选基因表达模式分析

上述6个基因在2个高表型、2个低表型及对照中相对表达量如图3所示。

由图3可知，Glyma.09G015100在低表型及高表型材料中相对表达量均高于对照材料，说明该基因在球蛋白表达中有促进作用，还可看出，在高表型材料R31/R190中相对表达量显著高于低表型材料R33/R153，初步说明，该基因对11S蛋白正调控。其余5个基因，在低表型及高表型材料中相对表达量均低于对照，对球蛋白负调控。认为Glyma.09G015100更具有研究价值，可在今后深入研究其功能。

表4 候选基因功能注释Table 4 Function annotation of the candidate genes

图3 候选基因在不同表性材料中相对表达量Fig.3 Relative expression levels of candidate genes in different surface materials

3 讨论与结论

研究表明，11S球蛋白对营养品质及加工特性影响优于7S球蛋白。11S球蛋白含量上升同时导致7S球蛋白含量下降，因此，可通过适当调整11S/7S球蛋白比值，实现大豆营养品质与加工特性改良。11S球蛋白含量有利于提高豆腐质构特性，与豆腐质构指标之间均呈正相关。Poysa等研究发现11S球蛋白中A3亚基对豆腐品质影响最大，A4亚基则对豆腐品质有负影响[15]。Nishinari等认为缺失11SA 5'端球蛋白大豆制成的豆腐品质更好[16]。Fukushima认为11S球蛋白中亚基与大豆蛋白凝胶速度和透明性密切相关[17]。Saio等认为11S球蛋白加热后形成的凝胶富有保水性，有较高拉应力及剪切力，在制成豆腐时凝胶硬度、弹性较好[18]。Kitamura等分析1 700份大豆种子蛋白亚基含量得出，一般大豆11S/7S比值为1.12[19]。刘香英等利用聚丙烯酰胺凝胶分析黑吉辽内蒙古四省163个大豆品种，发现11S/7S比值为1.3～3.32，平均值为1.97[20]。刘顺湖等鉴定我国138份野生豆、409份地方品种以及国内148份育成品种发现，11S/7S比值平均分别为1.4、2.0和2.7[21]。姜振峰等采用线性梯度SDS-PAGE法鉴定442份黑龙江省内大豆资源，结果表明11S/7S比值为0.93～2.77，平均值为1.7[22]。

关于大豆蛋白QTL定位研究较多，CSSL可用作QTL分析重要材料，因其在基因组中仅包含较少供体亲本片段，且遗传背景高度一致。鉴于这种材料的优越性，近年来已在水稻[23]、玉米[24]、大豆等农作物中广泛使用。野生和半野生资源包含稀有基因，具有抗逆性、抗病性和抗虫性。本研究以野生大豆ZYD00006为供体亲本，以栽培大豆SN14为轮回亲本构建CSSL群体。经多代回交后代，后代CSSL个体仅包含较少导入野生资源。大多数遗传背景恢复到SN14。野生资源特有优良基因被保留在个体中，不良特性被去除。通常，CSSL种群可作为创新资源直接或间接用于育种研究。将拟南芥同源基因功能信息（https://www.arabidopsis.org）与基因注释信息相结合，共同分析并筛选与11S/7S球蛋白比值性状相关候选基因。通过qRT-PCR分析，Glyma.09G015100可能是影响大豆11S/7S球蛋白比值的功能基因。Glyma.09G015100属于磷脂酰肌醇转移蛋白（sec14p）家族[24]，该家族主要定位在高尔基体中，高尔基体是蛋白质主要合成加工运输场所，参与来自高尔基体中各复合产物蛋白运输，可能影响大豆球蛋白中各亚基形成，进而影响7S/11S球蛋白比值，故将Glyma.09G015100作为影响大豆11S/7S球蛋白比值候选基因。本研究将为大豆11S/7S球蛋白比值分子标记辅助育种及相关基因克隆提供理论指导。