大豆硬实性QTL定位及上位性互作分析

滕卫丽，李 悦，郑立娜，郭志文，付 雪，王 博，董莹莹，韩英鹏，李文滨

（东北农业大学大豆研究所，大豆生物学教育部重点实验室，农业农村部东北农业大学生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030）

硬实是因种皮结构致密、抗渗能力强、吸胀能力差而产生的保护机制，使种子处于休眠状态并保持活力[1]，这种现象普遍存在豆科作物中。大豆在运输和存储过程中，种子硬实性有利于提高抵抗力，防止种子腐败和病原体入侵[2-3]。种子硬实与种皮中钙质含量相关[4]，可为大豆食品提供附加营养价值。但硬实性导致大豆发芽率低，延后出苗，不利于田间管理，严重影响大豆产量，不便于食品加工[5-6]。种皮渗透性是豆科作物驯化过程关键特性之一，硬实性严重阻碍大豆育种进程[7]。因此探究大豆硬实性遗传机制，挖掘硬实性相关QTL位点，对大豆种质资源利用和品种改良具有重要意义。

在形态学上，种子硬实性主要与种皮渗透性有关[8]。由角质层、栅栏层、皮下层等组成的复合多层种皮[9]是阻碍种子吸水关键因素，其中含有蜡质、纤维素、果胶质[10]及酚类化合物[11]，增强种皮抗渗能力。种脐是大豆种子吸水主要部位，具有控制水分进出的结构特性，结构关闭时有效阻隔外界水分，造成种子硬实[12]。在遗传学上，大豆硬实性受多基因调控[1]。早期研究中，Keim等在第2、3、6、8、19号染色体上获得与大豆硬实性相关RFLP标记[13]。Liu等选择以野生大豆品种为父本构建RIL群体分析大豆硬实性QTL，在第2号染色体上获得2个加性QTL，位于Satt459附近，贡献率大于40%[14]。艾丽娟等研究获得3个与大豆硬实性相关加性QTL位点，分别位于第2、6、14号染色体，其中第6号染色体上qHS-6-1位于标记区间Sat-402-Satt460之间[15]，与陈静静等检测到野生大豆硬实QTL区间Sat-402-Satt557部分重叠[16]。Kebede等发现种皮抗渗性为优势性状，受一个单基因控制，定位于第2号染色体Sat-202-Satt459标记之间[17]。Ramakrishn等在第4、8、9、11、18、20号染色体获得与种子渗透性相关基因组变异位点[18]。Sun等表示Glyma02g43700.1在编码钙调磷酸酶跨膜蛋白过程中，存在微效基因参与调控种皮渗透性[19]。由此可知，大豆硬实性遗传机制较为复杂。目前，大豆硬实性相关QTL间上位性互作逐渐受到重视，但相关报道较少，因此探究QTL间上位性互作关系及效应估值对明确大豆硬实性遗传机制具有重要意义。

本研究利用东农46与L-100构建RIL群体分析硬实性相关性状QTL定位及上位性互作，挖掘QTL新位点，为大豆分子辅助育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验材料为东北农业大学大豆研究所选育东农46和日本引进种质L-100杂交衍生的包含127个家系重组自交系群体。将该群体F2:9（2017年）和F2:11（2019年）播种于向阳，F2:10（2018年）年分别播种于向阳（XDL）、呼兰（HDL）和阿城（ADL）。田间采用随机区组设计，垄长2 m，垄宽65 cm，株距6 cm，3次重复。籽粒完全成熟后收获，手剥脱粒，避免机械损伤。

1.2 方法

1.2.1 大豆硬实率测定及种子类型划分

从亲本东农46和L-100中随机选取20粒表面光滑饱满无病斑种子，置于培养皿中并加入20 mL蒸馏水，3次重复，室温下浸泡处理24 h，每隔2 h统计硬实种子数（种子体积未变化且无皱缩现象记为硬实），计算硬实率，观察亲本硬实率变化趋势，确定群体硬实率调查时间。采用与亲本相同浸种法，分别在3、6、12和24 h时，测定RIL群体127个家系硬实率，并划分RIL群体硬实性。

硬实率（%）=未吸胀种子/供试种子数×100%。硬实型：硬实率≥80%；中间型：20%＜硬实率＜80%；吸胀型：硬实率≤20%[19]。

1.2.2 大豆种子吸水量测定

采用与测定硬实率相同浸种法，在浸泡处理3、6、12和24 h时，将培养皿中蒸馏水倒出，吸水纸将种子表面水珠擦干，万分之一天秤称量种子重量，称量完成后将种子放回培养皿中，加入20 mL蒸馏水继续浸泡。计算4个时间点种子吸水量。

吸水量（g）=吸水时间段后种子质量（g）-吸水时间前种子质量（g）[20]。

1.3 数据处理与分析

采用Excel 2016处理数据，SPSS 25.0软件包统计分析2017～2019年大豆硬实率和种子吸水量。

1.4 QTL定位

本研究所用遗传连锁图谱由东北农业大学大豆研究所大豆分子设计及全基因组编辑实验室利用全基因组重测序技术构建完成，图谱总长3 672.52 cM，共4 004个标记，分布于20条染色体，每条染色体上含有124～295个标记，各染色体图距126.29～286.25 cM[21]。利用QTL IciMapping 4.1软件中完备区间作图法（ICIM）作硬实性相关性状加性及上位性QTL定位分析，LOD阈值分别为2.5和4.0。采用McCouch等命名方式[22]。

2 结果与分析

2.1 大豆种子硬实性相关性状表型数据分析

由图1可知，在浸种处理24 h内，随时间增加，亲本东农46种子表皮皱缩，体积明显增大，硬实率逐渐下降，且浸种2 h时硬实率为0，6 h时种子均达到完全吸胀状态；而L-100硬实率在浸种处理24 h内无明显变化，16 h时出现少数完全吸胀种子。根据亲本表型差异，确定划分群体硬实性调查时间为6 h。由图2可知，RIL群体种子以6 h时硬实率为标准可分为3种类型，不同类型间数量差异明显，吸胀型＞中间型＞硬实型。

图1 亲本硬实率变化情况Fig.1 Change of parent hard seededness rate

图2 RIL群体浸种6 h种子类型分布情况Fig.2 Distribution of seed types in RIL populations at 6 h

2017～2019年5个环境下亲本及RIL群体表型分析结果如表1～2所示，在4个浸种时间条件下，东农46硬实率为0，种子吸水量为2.26～6.71 g，L-100硬实率为83.33%～100%，种子吸水量为0～0.77 g，两个性状在亲本间均存在显著差异，为QTL定位分析奠定基础。

在三年五点条件下，RIL群体硬实率平均值随时间逐渐减小，种子吸水量平均值随时间逐渐加大。浸种12 h时，硬实率平均值减量达最大，种子吸水量平均值增量达最大。由此可知，浸种0～12 h，群体种子处于急速吸水阶段；浸种12～24 h，群体种子处于缓慢吸水阶段。4个浸种时间段，群体硬实率为0～100%，变异系数为33.29%～83.13%，该性状在群体中分离程度较大，存在超亲分离，结合图3可知，群体硬实率表型值呈连续性变异，多环境下变化趋势相同，群体硬实率主要分布在0～10%；群体种子吸水量为0～6.71 g，变异系数为31.48%～61.53%，偏度绝对值均＜1，除个别数值外，浸种3 h条件下表现为正值右偏分布，且峰度绝对值＜1，浸种6、12和24 h条件下表现为负值左偏分布，峰度值为-0.43～3.03。结合图4可知，群体种子吸水量均呈近似正态连续性变异，且频率分布在5个环境下具有一致性，浸种3和6 h时，群体种子吸水量主要分布范围分别为1.0～1.5、2.0～2.5 g，浸种12和24 h时，主要分布范围为2.5～3.0 g，表明浸种12 h时群体中大部分种子达到完全吸胀状态。

如表3所示，分析多环境不同时间段群体硬实率和种子吸水量相关性。结果表明，在种子吸水过程中，硬实率与种子吸水量呈极显著负相关，硬实率越高，种子吸水量越低。

2.2 大豆硬实性QTL定位

利用完备区间作图法，对5个环境，浸种不同时间大豆硬实率和种子吸水量性状作QTL定位和加性效应分析，如表4所示。

表1 亲本及RIL群体硬实率表型分析Table 1 Phenotypic analysis of hard seededness rate of soybean parents and RIL populations

表2 亲本及RIL群体种子吸水量表型分析Table 2 Phenotypic analysis of seed water absorption of soybean parents and RIL population

续表2

图3 RIL群体硬实率频率分布直方图Fig.3 Histogram of hard seededness rate frequency distribution of soybean RIL population

图4 RIL群体种子吸水量频率分布直方图Fig.4 Histogram of seed water absorption frequency distribution of soybean RIL population

表3 RIL群体表型间相关性分析Table 3 Analysis of correlation between different phenotypes of RIL populations

表4 大豆硬实率QTL分析Table 4 QTL mapping analysis of hard seededness rate in soybean

由表4可知，大豆硬实率性状共检测到35个QTL位点，主要分布于第2、4、6、13、16、17、20号染色体。其中有6个QTL位点在不同时间段和环境下多次重复检测，分布于第2、4、13、16、17染色体。在2号染色体上定位到两个邻近QTL，qHS-2-1重复检测9次，贡献率为5.93%～32.28%，标记区间Block534～Block535；qHS-2-2重复检测7次，贡献率为18.70%～47.31%，标记区间Block535～Block536。在4号染色体上定位到两个邻近QTL，qHS-4-1重复检测6次，贡献率为10.20%～14.13%；qHS-4-2紧邻qHS-4-1，贡献率9.66%。在13号染色体上，qHS-13-1重复检测4次，贡献率为6.37%～12.81%。在16号染色体上，qHS-16-1重复检测3次，贡献率为5.29%～16.77%。在17号染色体上，qHS-17-1重复检测3次，贡献率为8.71%～10.27%。在6号和20号染色体上，分别各检测到1个QTL位点，qHS-6-1贡献率为16.07%，qHS-20-1贡献率为10.12%，均大于10%。加性效应为-0.15～0.28，其中25个QTL加性效应为正值，增效等位基因来源于L-100，与其具有较高硬实率一致，分布于第2、6、13、16、20号染色体，10个QTL加性效应为负值，增效等位基因来源于东农46，分布于第4、17号染色体，重复QTL位点加性效应具有一致性。

大豆种子吸水量QTL分析如表5所示。

表5 大豆种子吸水量QTL分析Table 5 QTL mapping analysis of seed water absorption in soybean seed

大豆种子吸水量性状共检测到42个QTL位点，主要分布于第2、3、4、6、12、13、16、17、18号染色体。其中有6个QTL位点在不同时间段和环境下多次重复检测，分布于第2、3、16、17、18号染色体。在2号染色体上定位到两个邻近QTL，qWAS-2-1和qWAS-2-2分别重复检测2次和17次，贡献率分别为16.22%～20.32%、14.04%～41.88%。在3号染色体上，qWAS-3-1重复检测2次，贡献率为7.05%～8.42%。在16号染色体上，qWAS-16-1重复检测3次，贡献率为9.27%～11.77%。在17号染色体上，qWAS-17-1检测4次，贡献率为6.37%～11.71%。在18号染色体上，qWAS-18-1重复检测4次，贡献率为10.01%～14.47%。在4号染色体上检测到3个QTL，2018年阿城3 h时定位出qWAS-4-3贡献率最高，为24.16%。在6号染色体上检测到3个QTL，2018年阿城12 h时定位出qWAS-6-2贡献率最高，为11.87%。在12号染色体上检测到1个QTL，贡献率为21.58%。在13号染色体上检测到4个QTL，2018年向阳24 h时定位出qWAS-13-4贡献率最高，为11.13%。加性效应为-0.89～0.41，其中8个QTL加性效应为正值，增效等位基因来源于L-100，分布于第4、6、13、17号染色体，34个QTL加性效应为负值，增效等位基因来源于东农46，与其具有较高种子吸水量一致，分布于第2、3、4、6、12、13、16、18号染色体，重复QTL位点加性效应具有一致性。

2.3 大豆硬实性QTL上位性效应分析

利用完备区间作图法作上位性QTL定位分析，对不同浸种时间硬实率和种子吸水量性状作QTL定位，分析QTL上位性互作对大豆硬实性影响，如表6所示。

表6 大豆硬实率上位性效应分析Table 6 Epistatic effect analyze of QTLs for hard seededness rate in soybean

由表6可知，在三年五点环境下，不同时间段共检测到27对硬实率上位性互作QTL。其中2号染色体上qHS-2-4与4号染色体上qHS-4-4、6号染色体上qHS-6-2、16号染色体上qHS-16-1发生上位性互作，且重复检测，贡献率为1.74%～6.61%；2号染色体上qHS-2-5与6号染色体上qHS-6-2、13号染色体上qHS-13-2、16号染色体上qHS-16-1发生上位性互作，贡献率为1.35%～6.06%；4号染色体上qHS-4-3、6号染色体上qHS-6-2和qHS-6-3、17号染色体上qHS-17-2与16号染色体上qHS-16-1发生上位性互作，贡献率为1.01%～2.72%。上述22对上位效应值均为正值，表现为亲本型大于重组型。2号染色体上qHS-2-3、qHS-2-4、qHS-2-5与17号染色体上qHS-17-2发生上位性互作，贡献率为1.58%～6.88%；3号染色上qHS-3-1与16号染色体上qHS-16-2发生上位性互作，贡献率为1.88%，上位效应值均为负值，表现为重组型大于亲本型。QTL位点qHS-2-4和qHS-16-1参与上位性互作次数较多，分别为14和12次，且qHS-2-4与qHS-2-1和qHS-2-2位点相邻。

如表7所示，在三年五点环境下，不同时间段共检测到24对种子吸水量上位性互作QTL，其中在浸种3 h时检测到2对，6 h时检测到7对，12 h时检测到5对，24 h时检测到11对，贡献率为2.42%～8.40%。共有6对上位效应值为正值，表现为亲本型大于重组型。18对上位效应值为负值，表现为重组型大于亲本型，其中7号染色体上qWAS-7-2与20号染色体上qWAS-20-7发生上位性互作，重复检测2次，贡献率为4.16%和8.40%。13号染色体上qWAS-13-5和19号染色体上qWAS-19-1发生上位性互作，重复检测2次，贡献率为2.63%和4.35%。

表7 大豆种子吸水量上位性效应分析Table 7 Epistatic effect analyze of QTLs for seed water absorption in soybean seed

3 讨 论

前人多选用硬实率（或吸胀率）性状作大豆硬实性QTL分析，本研究调查不同浸种时间硬实率和种子吸水量，两个性状间具有极显著相关性。根据三年五点环境下表型数据分析大豆硬实率和种子吸水量QTL定位和加性效应，探究大豆硬实性分子遗传机制，共检测到26个与大豆硬实性相关加性QTL，主要分布于第2、3、4、6、12、13、16、17、18、20号染色体。

Kebede等在标准发芽条件下调查种皮不透水率，划分群体种皮类型，并在第2号染色体上获得与种皮渗透性相关QTL，位于Sat_202-Satt459之间[17]，Liu等检测到与大豆硬实相关QTL位点在Satt459附近[14]，二者结果一致。艾丽娟等[15]、陈静静等[16]分别以硬实率、吸胀率为表型性状，通过分子标记技术获得与大豆硬实性相关QTL位点，均在第2号和第6号染色体上检测到QTL位点，且标记区间邻近。本研究分别以硬实率和种子吸水量为表型性状，以时间为单位细化表型变化，分析大豆硬实性QTL定位，在第2号染色体上多次重复获得4个与大豆硬实性相关加性QTL，qHS-2-1和qWAS-2-1、qHS-2-2和qWAS-2-2标记区间重叠，在Block534～Block535、Block535～Block535之间，贡献率平均值＞20%，在第6号染色体上获得4个大豆硬实性加性QTL，其中qHS-6-1贡献率为16.07%，定位在Block1822～Block1824之间。

Sun等研究发现GmHs1-1基因编码钙调磷酸酶跨膜蛋白，导致大豆种皮中钙质含量增多，种皮透水性差，出现硬实现象[19]。Jang等通过转基因技术验证Glyma02g43680可促进栅栏细胞外层1,4-β-葡聚糖积累，改变种脐结构，导致种子吸水能力差，出现硬实现象[23]。由此可知，控制大豆硬实性基因较为复杂，并非单一基因调控。

Ramakrishn等通过对G.max和G.soja作全基因组重测序，发现与种皮渗透性相关基因组变异（SNPs和InDels），主要分布在4、8、9、11、18、20染色体[18]。本研究中，在第4号染色上获得5个大豆硬实性加性QTL，其中qHS-4-2和qWAS-4-1标记区间重叠，第18号染色体上qHS-18-1 QTL位点重复检测3次，且贡献率均大于10%，第20号染色体上获得qHS-20-1 QTL位点，贡献率为10.12%。此结果与Ramakrishn等发现与种皮渗透性相关基因突变位点所在染色体一致[18]，增加3条染色体上大豆硬实性QTL新位点可信度。在多环境下不同浸种时间段，16、17号染色体上重复获得4个大豆硬实性加性QTL，尚未见报道，4个新位点在大豆硬实性遗传研究方面具有重要价值。

目前关于大豆硬实性上位性互作效应研究较少。艾丽娟等检测到4对与种子硬实相关QTL间的上位性互作效应，其中第6号染色体上主效QTL与第2号染色体上的主效QTL及第9、12号染色体上次效QTL间发生上位性互作效应，反映QTL所在基因位点间正向诱导表达或负向反馈抑制调控[15]。本研究获得51对加性×加性上位性互作QTLs，分布于第2、3、4、6、7、8、9、10、13、16、17、18、19、20号染色体，可解释表型变异率为1.01%～8.40%。其中qHS-2-4、qHS-4-4、qHS-6-2和qHS-16-1多次出现在QTL上位效应互作对中，说明大豆硬实性复杂基因网中，QTL之间加性×加性上位性互作也发挥重要作用，为进一步探究大豆硬实性遗传机制提供依据。

4 结 论

a.大豆硬实率与种子吸水量两个性状呈极显著负相关。

b.第2号染色体上多次重复定位得到4个与大豆硬实性相关QTL位点，其中qHS-2-1与qWAS-2-1定位区间重叠，贡献率分别为5.93%～32.28%和16.22%～20.32%；qHS-2-2与qWAS-2-2定位区间重叠，贡献率分别为18.70%～47.31%和14.04%～41.88%；且在4个时间段均被检测到，说明以上4个大豆硬实性QTL新位点可信度更高。

c.共检测到51对上位性互作QTL，可解释表型变异率为1.01%～8.40%，多次重复检测到3个QTL互作对，分别为qHS-2-4和qHS-4-4、qHS-2-4和qHS-6-2、qHS-2-4和qHS-16-1。