闹羊花不同炮制品的“减毒-存效”比较研究

郭小红，冯靖雯，张小琼，尤 强，陈鸿平，刘友平*

1.成都中医药大学药学院，西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137

2.重庆市中医院，重庆 400021

闹羊花为杜鹃花科杜鹃属植物羊踯躅Rhododendron molle(Blume) G.Don.的干燥花，始载于《神农本草经》，有大毒，羊食时踯躅而死，故以此为名[1]。其具有祛风除湿、散瘀定痛的功效，自古广泛应用于风湿痹症[2-3]。但与此同时其“毒性”问题也备受关注。闹羊花毒性剧烈，安全窗较窄，有效剂量接近中毒剂量，导致临床中毒事件屡有发生，极大地限制了其临床应用及深度开发。因此，在确保临床药效前提下，提出有效的减毒策略，成为目前研究的关键。

中药炮制技术可降低闹羊花毒性。闹羊花在古代多炮制入药，最早可追溯到东晋《肘后备急方》[4]：“清酒二斗渍之”“苦酒渍药一宿”，《本草纲目》[5]也有记载“贼风走皮中淫淫痛……酒蒸为末”“酒拌蒸一炊久”。然而，现今无论是国家标准还是地方标准，均未收录闹羊花炮制品。闹羊花作为《中国药典》2020年版[2]10 种“大毒”中药材之一，是唯一一味无炮制规格的可供内服的“大毒”中药材，古代炮制方法均未得到较好的传承和发展。《中国民族药炮制经验集成》[6]收录了闹羊花酒蒸、炒2种炮制方法，并明确其炮制作用为“生品有毒，蒸、炒可降低毒性”，然而对其炮制“减毒”作用，目前尚缺乏科学依据，亦未见文献报道。

现代研究表明，闹羊花主要成分为二萜类、黄酮类、三萜类、木脂素类，其中二萜类成分为该药材特征性成分，该类成分具有强烈毒性，同时也是药效成分，具有双重生理作用，低剂量表现为抗炎、镇痛、免疫抑制、降血压等药理作用，高剂量表现为对神经系统、脏器系统、呼吸系统的毒性[7]。对毒性成分也是药效成分的闹羊花而言，炮制减毒技术是降低其毒性的主要目的，但不是唯一目的，在降低毒性的同时保存较高的疗效才是最终目标[8]。因此，本研究以古籍记载的炮制方法为依据“遵古炮制”，采用“外观性状-化学成分-毒性-药效”多角度评价模式，分析闹羊花炮制前后及不同炮制品的差异，以筛选最佳“减毒存效”的辅料及炮制方法，为后期闹羊花减毒存效机制、炮制工艺、质量标准等研究奠定理论依据，以期为临床提供“低毒高效”的闹羊花炮制品种，保障临床用药安全有效。

1 材料

1.1 仪器

Thermo Ultimate 3000 液相色谱仪、Coron Veo RS 电雾式检测器（赛默飞世尔科技有限公司）；BN3000 型万分之一电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；CP2000 型十万分子一电子天平（德国Sartorius 公司）；HX-200k 型高速粉碎机（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；UPTUO-I-1000TE 优普系列超纯水机（成都纯水科技有限公司）；DHG-9245A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SG8200HDT 型超声波清洗器（上海冠特超声仪器有限公司）；Waters C18色谱柱（Sysmmetry ShieldTMRP18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；CM-5 型分光测色仪（日本柯尼卡美能达公司）；实验用鼠耳打孔器（泽雅科教有限公司）。

1.2 试药

闹羊花药材（批号20200103）购自湖北富饶农业药用植物繁育基地，经成都中医药大学中药资源与鉴定系严铸云教授鉴定为杜鹃花科杜鹃属植物羊踯躅R.molle(Blume) G.Don.的干燥花。甲醇（色谱纯，美国MTEDIA 有限公司），甲醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），实验用水为超纯水，醋、黄酒购自永辉超市。闹羊花毒素 III 对照品（批号11984-201901）、闹羊花毒素 II 对照品（批号11983-201901）购自中国食品药品检定研究院（质量分数≥98%），闹羊花毒素V 对照品（批号DS7190922）购自德思特生物有限公司（质量分数≥98%）。

1.3 动物

SPF 级昆明种小鼠356 只，雌雄各半，4～6 周龄，体质量18～22 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2019-0004。动物饲养温度为（20.0±0.5）℃，湿度（55±5）%。本研究严格按照中华人民共和国科技部《动物实验管理条例》的要求进行。动物实验规程经重庆市中医院动物实验伦理委员会批准（批准号为2019KY-GXH）。

2 方法与结果

2.1 闹羊花不同炮制品的制备

根据古籍记载“遵古炮制”，具体炮制方法见表1。

表1 闹羊花生品及其炮制品信息Table 1 Information of raw product and processed products of Rhododendri Mollis Flos

2.2 闹羊花生品及不同炮制品颜色比较

2.2.1 肉眼观察 采用相机（佳能 Canon IXUS285HS）对不同样品进行拍摄，见图1。结果可见，闹羊花生品为灰黄色，经炮制后均变为棕褐色，生品与炮制品的颜色差别较大，易区分，不同炮制品之间的颜色差异不明显。

图1 闹羊花生品及其炮制品肉眼观察比较Fig.1 Comparison of raw product and processed products of Rhododendri Mollis Flos by naked eye observation

2.2.2 颜色的测定 采用分光测色仪对闹羊花生品及其炮制品的颜色指标进行测量并记录。测量条件：光源D65；标准观察角度是10°；照明口径Ф30 mm；照明系统镜面反射。L*代表明亮度，L*越大，明亮度越大，反之越小；a*代表红绿色度，＋a*为红色方向，反之为绿色方向，＋a*越大，则颜色越红，反之则颜色越绿；b*代表黄蓝色度，＋b*为黄色方向，反之为蓝色方向，＋b*越大，则颜色越黄，反之则颜色越蓝[6]。

取闹羊花生品及不同炮制品，粉碎，过2 号筛，取适量粉末放入色差仪粉末测试盒测定，见图2。结果表明，闹羊花炮制前后粉末的颜色存在较大差异，以L*（亮度值）变化最大，其次是b*（黄度值）；不同炮制品（S2～S4）之间颜色无明显差异。

2.3 闹羊花毒素II、III、V 的含量测定

2.3.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取闹羊花毒素II、闹羊花毒素III、闹羊花毒素V 对照品适量，加甲醇溶解，制成质量浓度分别为860.09、670.06、310.03 μg/mL 的混合对照品溶液。

图2 闹羊花生品及其炮制品颜色测定 (空间法)Fig.2 Determination of color of Rhododendri Mollis Flos raw product and its processed products (spatial method)

2.3.2 供试品溶液的制备 精密称取闹羊花药材粉末（过4 号筛）2.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，浸泡20 min，称定质量，超声提取1 h，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足，过0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3.3 色谱条件 Waters C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇（A）-流动相水（B）梯度洗脱：0～10 min，20%～30% A；10～30 min，30%～40% A；30～50 min，40%～50% A。体积流量0.8 mL/min；柱温35℃；进样量20 μL；电喷雾检测器以氮气为载气，雾化温度35 ℃，功能参数PF（power function）为1.0，采集频率10 Hz，过滤常数3.6。本实验条件下所测的3种成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5 与其他组分分离完全，拖尾因子在0.95～1.05，理论塔板数大于6000，色谱系统适用性实验符合含量测定要求。混合对照品溶液、供试品溶液（S1～S4）的色谱图见图3。

图3 闹羊花生品及其炮制品的HPLC-CAD 图谱Fig.3 HPLC-CAD chromatograms of raw product and processed products of Rhododendri Mollis Flos

2.3.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0 mL 分别置5 mL 量瓶中，用80%甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得；分别精密吸取上述混合对照品溶液各20 μL 进样，测定，以进样质量浓度（μg/mL）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果见表2，r均大于0.999 5，表明3 种被测成分在各自线性范围内呈良好线性关系。

2.3.5 方法学考察 取同一批闹羊花的供试品（S1），制备供试品溶液，进样测定，分别进行精密度试验、重复性试验、稳定性试验，计算各色谱峰的相对峰面积与相对保留时间。结果显示各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，表明方法精密度及重复性良好，且供试品溶液在24 h 内稳定，符合含量测定要求。

2.3.6 样品测定 精密称取闹羊花生品（S1）及不同炮制品（S2～S4），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取20 μL，按“2.3.3”项下色谱条件测定，计算样品含量，见表3。结果表明，经炮制后3 种成分的含量均有所降低，总量顺序为生品（0.340%）＞清蒸（0.181%）＞酒蒸（0.178%）＞醋蒸（0.154%），其中醋蒸品降低了约50%。闹羊花毒素III 以醋蒸品降低最多，闹羊花毒素V 以酒蒸品降低最多，闹羊花毒素II 以醋蒸品降低最多。

表2 线性关系考察Table 2 Linear relationship investigation

表3 指标性成分含量测定结果 (n=3)Table 3 Determination results of index components content (n=3)

2.4 闹羊花生品及其不同炮制品的急性毒性评价

2.4.1 供试药的制备 分别取闹羊花生品（S1）及不同炮制品（S2～S4）各20 g，加25 倍量的60%乙醇，加热回流提取2 次，每次1 h，滤过，合并滤液，50 ℃减压浓缩至50 mL，冷藏备用。上述各样品临用前用CMC-Na 溶液稀释成所需浓度。

2.4.2 急性毒性预试验 参照《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》[7]进行急性毒性实验，观察各组药物的毒性反应，测定致死剂量。采用少量动物探索剂量范围，取小鼠16 只，体质量23～27 g，雌雄各半，随机分成闹羊花生品组、清蒸组、酒蒸组、醋蒸组4 组，相邻组间剂量比为0.5，ig给药，每次给药容量为0.02 mL/g，得出各炮制品的0～100%致死量（Dn～Dm）。

2.4.3 急性毒性正式实验 根据Dm（生品为4.0 g/kg，炮制品均为6.0 g/kg）和Dn（生品为1.3 g/kg，炮制品均为1.8 g/kg），每个药物设置5 个剂量，相邻组间剂量比为0.75。取200 只小鼠，雌雄各半，随机分为闹羊花生品组、清蒸组、酒蒸组、醋蒸组，各组再分为5 个不同剂量组，每组10 只。给药前小鼠禁食不禁水，次日各组小鼠分别ig 相应剂量药物，给药体积为20 μL/g。给药后观察每组小鼠的中毒症状、生存状态，连续观察14 d，记录各组小鼠的毒性反应出现时间、死亡时间、死亡数量。

2.4.4 急性毒性结果 从ig 后5 min，各组小鼠均出现不同程度的中毒症状，表现为出汗、腹泻、口吐白沫、运动不协调、呼吸急促、痉挛、僵直、大小便失禁等，抽搐，直至死亡，死亡时间集中在给药后2 h 内。解剖死亡小鼠可见肺部有不同程度水肿，胃胀、部分肠管充盈，心肌肥大，肝脏发黑。根据各组小鼠死亡数计算出死亡率，见表4。半数致死量（median lethal dose，LD50）是判断中药有无毒性及毒性大小的依据，毒性与LD50呈负相关，一般认为大毒中药LD50＜5 g/kg，有毒中药LD50介于5～15 g/kg，采用Bliss法计算LD50及LD50的95%可信限，见表5。急性毒性结果表明，闹羊花经炮制后急性毒性均有所降低，尤以醋蒸品毒性最低，LD50的大小顺序为醋蒸＞酒蒸＞清蒸＞生品。

2.5 闹羊花生品及其不同炮制品的抗炎作用评价

2.5.1 分组及给药 取140 只小鼠，体质量28～32 g，雌雄各半，随机分为14 组，分别为模型组，阳性对照组（雷公藤多苷片120 mg/kg），闹羊花生品及其炮制品（清蒸、酒蒸、醋蒸）的高、中、低剂量（1200、600、300 mg/kg）组，每组10 只，各剂量设置参考人的临床给药量及小鼠的LD50。各组小鼠ig 相应剂量的药物，模型组小鼠ig 等体积纯水，给药体积均为0.2 mL/10 g，1 次/d，连续7 d。

2.5.2 小鼠耳肿胀抑制率的测定 末次给药60 min后，在小鼠单侧耳朵（右耳）的前后两面涂抹30 μL二甲苯致炎，干预30 min 后沿耳廓基线剪下双耳，用直径8 mm 的打孔器分别在两耳片同一部位（沿耳缘）打孔，置于天平精密称质量。计算小鼠耳肿胀度、耳肿胀抑制率[8]。

肿胀度＝右耳质量－左耳质量

肿胀抑制率＝(模型组肿胀度－给药组肿胀度)/模型组肿胀度

表4 各组小鼠死亡率比较Table 4 Comparison of mortality rates of mice in each group

表5 LD50 测定及毒性分级Table 5 Determination of LD50 and toxicity classification

2.5.3 抗炎作用结果 闹羊花炮制前后对二甲苯致炎模型小鼠都有很好的抗炎作用，尤以生品抗炎作用最强，抗炎作用强度为生品高剂量组（73.25%）＞生品中剂量组（58.39%）＞酒蒸高剂量组（49.63%）＞醋蒸高剂量组（42.48%）＞清蒸高剂量组（40.56%），炮制后抗炎药效均有所降低，但相较模型组，各炮制组高剂量均有明显抗炎作用（P＜0.05、0.01），起到了很好的炮制“存效”目的。结果见表6。

3 讨论

近年来报道多例闹羊花中毒事件[9-13]，引起社会舆论热点，当务之急是如何在中医药理论指导下降低用药风险，减少毒性事件发生。中药炮制技术可降低闹羊花的毒性，经课题组前期闹羊花炮制历史沿革考证，古代方书中闹羊花多经炮制后入药，所采用的炮制辅料以酒、醋为主流，故本研究选取酒、醋为辅料。本研究在挖掘古籍的基础上，采取“遵古炮制”制备闹羊花的不同炮制品，古籍中关于闹羊花的辅料用量和润药时间的记载不明，只简单提及“拌匀”“拌令湿润”[14-15]，即指适量的辅料以拌匀润透为宜。关于闹羊花蒸制时间为“一炊久”，如宋代《集验方》[16]“如炊一斗米许顷”；《普济方》[17]“酒拌蒸一炊久”，并一直延续到明代《本草纲目》[5]“酒拌蒸一炊久”。经考证，古代“一炊久”就是做一顿晚饭所用时间，大致在0.5～1.0 h。《中国民族药炮制集成》[6]记载“酒蒸：取闹羊花用酒喷湿后，拌匀，蒸半个小时，取出，晒干”，可见古今描述基本一致。因此，本研究“遵古炮制”：取闹羊花100 g，辅料用量45 g 拌匀润透，置于蒸笼中隔水蒸0.5 h，取出，50 ℃烘干，即得。

表6 各组小鼠耳肿胀抑制率Table 6 Inhibitory rates of ear swelling of mice in each group

据报道二萜类成分是闹羊花的毒效物质，闹羊花毒素II、III、V 是其二萜类代表性成分[18-21]，课题组前期采用HPLC-CAD 法建立了闹羊花中闹羊花毒素II、III、V 的含量测定方法。本研究在此基础上，采用该方法测定闹羊花生品及其不同炮制品含量差异，结果表明经炮制后毒性指标性成分含量明显降低，但是3 种炮制品的差异不明显，可见炮制辅料醋、酒对3 种成分影响较小，成分含量降低的原因可能是受加热过程的影响。参考其他物质基础为萜类的毒性中药炮制机制，芫花经醋制后毒性成分二萜原酸酯类成分发生酯键水解而含量降低[22]，甘遂经醋制后毒性成分巨大戟二醇型二萜类酯键水解而含量降低[23]；川楝子中毒性成分三萜类成分炒制加热过程中发生醚环开环或酯键水解反应进一步裂解导致其含量降低[24]。闹羊花中毒性成分二萜类含量降低也可能发生了化学成分转化，但反应机制有待进一步研究。

采取小鼠急性毒性实验测定致死率和LD50，探讨减毒效果，结果发现闹羊花炮制后LD50明显升高，表明临床使用安全性提高，达到了“减毒”的目的，尤以醋制为优，这可能跟辅料醋本身药效作用有关。醋，性温，味酸、苦，具有引药入肝、活血止痛、降低毒性、缓和药性的作用，毒性中药大戟、甘遂、芫花等醋制后降低了毒性又缓和了浚泄作用[25]。闹羊花毒性成分也是主要有效成分，“减毒”的同时更大的“存效”才是炮制的目的，因此进一步采用小鼠耳肿胀实验评价闹羊花炮制的“存效”作用，结果表明闹羊花生品和炮制品均能很好地抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀，具有很好的抗炎作用，起到了炮制“存效”目的，尤以酒制为优，可能与辅料酒的协同作用有关。酒，性大热，能宣通血脉、御寒气、行药势，可治疗风湿痹痛，引导药物作用到达治疗部位，用于制药能起到协同作用，增强疗效，如当归、川芎、白芍、白花蛇舌草等活血化瘀药多酒制[26]。

综上所述，本研究通过综合分析闹羊花炮制前后的性状、指标性成分、毒性、药效之间的关系，发现闹羊花经炮制后（清蒸、酒蒸、醋蒸）均能达到“减毒存效”的目的，“减毒”效果以醋制为优，“存效（抗炎）”效果以酒制为优，为临床用药炮制品的选择提供了科学依据。同时，本研究构建了以“外观性状-化学成分-毒性-药效”多角度联合评价，为毒性中药饮片新型质量评价模式提供研究思路。本研究仍存在一些不足，毒性成分变化仅选取了3个代表性成分进行定量测定，炮制前后全面化学信息有待进一步分析，炮制“减毒存效”机制尚不明确。因此，课题组已展开了闹羊花炮制的物质基础及作用机制的系统研究，以阐释其“炮制减毒”的科学内涵。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突