五加枝叶中1个新的羽扇豆烷型三萜

刘荷秀，徐凌玉，贾瑞芳，黄美玲，李振麟，钱士辉,

1.南京中医药大学附属省中西医结合医院，江苏 南京 210028

2.江苏省中医药研究院，江苏 南京 210028

3.南京市莫愁中等专业学校 药学系，江苏 南京 210017

4.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014

五加Acanthopanax gracilistylusW.W.Smith var.gracilistylus为五加科五加属多年生灌木，主要分布于我国中南、西南地区及山西、陕西、江苏、安徽、浙江、江西、福建等地，其干燥根皮为常用中药五加皮，有祛风湿、补益肝肾、强筋壮骨、利水消肿的功效[1]。研究表明五加中含有挥发油、黄酮、生物碱、脂肪酸、苯丙素、神经酰胺和萜类化合物[2-4]。萜类化合物是五加中的一类重要成分，目前发现五加的枝叶中含有大量三萜类成分，而根皮的主成分为二萜类[5]。五加叶中三萜类成分具有显著的保肝、抗炎[6-7]、抗肿瘤[8]等药理活性。为了提高五加地上部分资源综合利用效率，寻找新的活性成分，本实验对江苏产五加地上部分进行化学成分研究，从70%乙醇提取物中分离鉴定出了1 个新的降羽扇豆烷型三萜3α,4α,11α-三羟基降-23-碳羽扇豆-20(29)-烯-28-酸 [3α,4α,11α-trihydroxy-23-norlup-20(29)-ene-28-oic acid，1]和4 个已知的羽扇豆烷型三萜类成分3α,11α-二羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸[3α,11α-dihydroxylup-20(29)-ene-28-oic acid，2]、23-氧-3α,11α-二羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸[23-oxo-3α,11α-dihydroxylup-20(29)-ene-28-oic acid，3]、23-氧-3α-羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸[23-oxo-3αhydroxylup-20(29)-ene-28-oic acid，4]和3α-羟基羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸[3α-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid，5]。结构见图1。其中，化合物1 命名为新印象酸。活性实验结果表明化合物1对人骨肉瘤143B 细胞无显著细胞毒活性。

1 仪器与材料

图1 五加地上部分羽扇豆三萜类化学成分结构Fig.1 Structures of compounds from aerial parts of A.gracilistylus var.gracilistylus

Agilent 1100 系列LC-MS D Trap 质谱仪（美国安捷伦公司）；ULTRA SHIELD 500 plus 核磁共振波谱仪（德国布鲁克公司）；APS 10 制备液相色谱仪（北京元宝山色谱科技有限公司）；Waters 2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；RE-52A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；Thermo BDS HYPERSLL-C18（250 mm×10 mm，5 μm；250 mm×4.6 mm，5 μm，Thermo 公司）；柱色谱硅胶（青岛海洋化工厂）；薄层色谱硅胶板（烟台江友开发有限公司）；凝胶Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech公司）；除色谱用试剂为色谱纯，其余均为分析纯。

人骨肉瘤143B 细胞株购自美国ATCC 公司，由本实验室传代培养并保存；MTT（美国Sigma 公司）；DMEM 培养基和胎牛血清（美国Gibico 公司）；胰蛋白酶、PBS 和DMSO（江苏凯基生物技术股份有限公司）。

五加地上部分2018年5月采集于江苏省盱眙县，经江苏省中医药研究院钱士辉研究员鉴定为五加科植物五加A.gracilistylusW.W.Smith var.gracilistylus的枝叶，凭证标本（JSTCMIBS-180511）存放于江苏省中医药研究院。

2 提取与分离

五加地上部分干燥药材34 kg，用10 倍量70%乙醇回流提取3 次，每次1.5 h，提取液经常压蒸馏和减压浓缩，得到流浸膏20 L，水分散后生成大量沉淀，离心，沉淀部分（570 g）经20～60 目硅胶柱色谱，采用石油醚、石油醚-醋酸乙酯（1∶1）、醋酸乙酯-乙醇（1∶0、1∶1）、乙醇作为洗脱剂进行梯度洗脱，得到53 个组分WJ1～WJ53。WJ33～WJ35（48 g）合并后经100～200 目硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇（15∶1、8∶1、4∶1）梯度洗脱，其中三氯甲烷-甲醇（8∶1）洗脱部分（2.3 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱[甲醇-三氯甲烷（1∶1）洗脱]和制备高效液相色谱[甲醇-水（78∶22），tR＝6.69 min]分离纯化，得到化合物1（37 mg）；三氯甲烷-甲醇（4∶1）洗脱部分（5.2 g）经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱[甲醇-三氯甲烷（1∶1）]和制备型高效液相色谱[甲醇-水（49∶51），tR＝9.33 min]分离纯化，得到化合物4（55 mg）。WJ23～WJ25（135.3 g）合并后经100～200 目硅胶柱色谱，三氯甲烷-甲醇（20∶1、10∶1、5∶1）梯度洗脱，三氯甲烷-甲醇（20∶1）洗脱部分在二氯甲烷中生成大量结晶，乙醇重结晶后得到化合物2（3.5 g）；三氯甲烷-甲醇（10∶1）洗脱部分经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱[甲醇-三氯甲烷（1∶1）]后重结晶得到得化合物3（30 mg）和5（360 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末（甲醇），易溶于三氯甲烷等。TLC 检查10%硫酸乙醇加热显淡黄色；(nm):226；(cm−1):3414,3035,2981,1715,1623,1493,1181；HR-ESI-MSm/z:473.329 1 [MH]−（C29H45O5），提示化合物1 的分子式为C29H46O5，不饱和度为7。13C-NMR (125 MHz,CD3OD) 谱中显示29 个C 信号，DEPT 提示含5 个CH3、10 个CH2、7 个CH 和7 个季碳信号，提示1 可能是降三萜类化合物。1H-NMR (500 MHz,CD3OD) 谱中δ4.75 (1H,brs),4.61 (1H,brs),1.72 (3H,brs) 及13CNMR 谱中δ110.4,151.6,19.6 的信号推断结构中含有异丙烯基，提示化合物为羽扇豆烷型三萜，δ3.43(1H,t,J=2.8 Hz),3.86 (1H,m) 以及13C-NMR 谱中δ74.8,71.0,74.1 信号提示结构中含有3 个氧取代碳，δ1.07 (3H,s),1.05 (3H,s),1.01 (3H,s),0.97 (3H,s) 为角甲基氢信号。

将化合物1 的13C-NMR 谱数据（表1）与已知化合物3α,11α,23-三羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸（1a）的碳谱数据[9]对照，发现除A 环上部分数据有位移外其余数据基本一致。化合物1 的C-3 位化学位移向高场位移δ1.1，C-5 位化学位移向低场位移δ7.2，C-24 位化学位移向低场位移δ3.7，C-23位及C-4 位对应的化学位移值缺失，而多出δ74.1的氧取代季碳信号，因此推断化合物1 可能为C-23位-CH3被-OH 取代的降碳化合物。通过HMBC 谱分析发现H-3 (δ3.43) 与C-1 (δ35.8)、C-24 (δ22.0)相关，H-6 (δ1.38) 与C-4 (δ74.1) 相关，H-24 (δ1.07) 与C-4 (δ74.1) 和C-5 (δ51.1) 相关，证明C-4位为1 个甲基和1 个羟基取代的季碳；NOESY 谱中H-3 (δ3.43) 与H-24 (δ1.07)、H-2β (δ1.75)、H-2α(δ1.57) 相关，H-24 (δ1.07) 与H-25 (δ1.01)、H-26(δ0.97)、H-3 (δ3.43)、H-2β (δ1.75) 相关，进一步证明C-4 位为α-OH 取代。综上所述，推断化合物1 结构为3α,4α,11α-三羟基-23-降羽扇豆-20(29)-烯-28-酸，该化合物为天然产物中比较罕见的23-降羽扇豆三萜，为1 个新化合物，命名为新印象酸。

化合物2：无色针晶（甲醇），易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂，ESI-MSm/z:507.3 [M＋Cl]−。1HNMR (500 MHz,CDCl3)δ:4.77 (1H,brs,H-29a),4.63 (1H,brs,H-29b),3.95 (1H,m,H-11),3.37 (1H,dd,J=2.6,3.0 Hz,H-3),1.70 (3H,brs,H-27),1.05(3H,s,H-26),1.01 (3H,s,H-25),0.94 (3H,s,H-24),0.85 (3H,s,H-23)；13C-NMR (125 MHz,CDCl3)δ:35.6 (C-1),25.7 (C-2),76.0 (C-3),37.9 (C-4),49.0(C-5),18.1 (C-6),35.3 (C-7),42.4 (C-8),55.8 (C-9),39.3 (C-10),70.6 (C-11),37.0 (C-12),37.4 (C-13),42.8 (C-14),30.7 (C-15),32.3 (C-16),56.4 (C-17),46.8 (C-18),48.9 (C-19),149.9 (C-20),29.7 (C-21),37.0 (C-22),28.8 (C-23),22.4 (C-24),17.5 (C-25),16.4 (C-26),14.8 (C-27),181.4 (C-28),110.3 (C-29),19.5 (C-30)。上述数据与文献波谱数据对照基本一致[10]，故鉴定化合物2 为3α,11α-二羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸。

化合物3：无色方晶（乙醇），易溶于甲醇、氯仿等有机溶剂，ESI-MSm/z:485.2 [M－H]−。1HNMR (500 MHz,CDCl3)δ:9.54 (1H,s,H-23),4.76(1H,brs,H-29a),4.62 (1H,brs,H-29b),3.97 (1H,m,H-11),3.71 (1H,brs,H-3),2.99 (1H,m,H-19),1.69(3H,brs,H-30),1.08 (3H,s,H-25),1.04 (3H,s,H-24),1.02 (3H,s,H-26),0.95 (3H,s,H-27)；13CNMR (125 MHz,CDCl3)δ:34.9 (C-1),26.3 (C-2),72.9 (C-3),52.6 (C-4),43.7 (C-5),20.8 (C-6),34.8(C-7),42.6 (C-8),55.6 (C-9),38.7 (C-10),70.5(C-11),38.0 (C-12),37.5 (C-13),43.2 (C-14),29.7(C-15),32.3 (C-16),56.5 (C-17),49.0 (C-18),46.9(C-19),149.9 (C-20),30.8 (C-21),37.0 (C-22),209.4(C-23),14.9 (C-24),16.6 (C-25),17.6 (C-26),14.9(C-27),181.4 (C-28),110.3 (C-29),19.5 (C-30)。上述数据与文献对照基本一致[11]，故鉴定化合物3 为23-氧-3α,11α-二羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸。

化合物4：无色针晶（乙醇），易溶于氯仿、甲醇等有机溶剂，ESI-MSm/z:469.1 [M－H]−。1HNMR (500 MHz,Pyr-d5)δ:10.05 (1H,s,H-23),4.95(1H ,brs,H-29a),4.77 (1H,brs,H-29b),4.03 (1H,m,H-3),3.39 (1H,m,H-19),1.70 (3H,s,H-30),1.03(3H,s,H-25),0.99 (3H,s,H-24),0.92 (3H,s,H-26),0.82 (3H,s,H-27)；13C-NMR (125 MHz,Pyr-d5)δ:33.5 (C-1),26.7 (C-2),72.9 (C-3),52.5 (C-4),44.3(C-5),21.0 (C-6),34.6 (C-7),41.8 (C-8),50.6 (C-9),38.0 (C-10),21.1 (C-11),26.9 (C-12),38.4 (C-13),43.6 (C-14),30.2 (C-15),32.7 (C-16),56.9 (C-17),49.8 (C-18),47.6 (C-19),151.0 (C-20),31.1 (C-21),36.9 (C-22),209.5 (C-23),14.7 (C-24),16.6 (C-25),16.6 (C-26),14.8 (C-27),179.4 (C-28),109.9 (C-29),19.5 (C-30)。上述数据与文献对照基本一致[12]，故鉴定化合物4 为23-氧-3α-羟基羽扇豆-20(29)-烯-28-酸。

表1 化合物1 的NMR 数据 (500/125 MHz,CD3OD)Table 1 NMR data of compound 1 (500/125 MHz,CD3OD)

化合物5：无色柱晶（乙醇），易溶于甲醇、氯仿等有机溶剂，ESI-MSm/z:485.3 [M－H]−。1HNMR (500 MHz,Pyr-d5)δ:4.94 (1H,brd,J=2.0 Hz,H-29a),4.78 (1H,brd,J=2.0 Hz,H-29b),4.28 (1H,brs,H-3),3.54 (1H,m,H-19),2.70 (1H,ddd,J=3.4,12.0,12.3 Hz,H-13),1.78 (3H,brs,H-30),1.46 (3H,s,H-24),1.13 (3H,s,H-26),0.96 (3H,s,H-25),0.95(3H,s,H-27)；13C-NMR (125 MHz,Pyr-d5)δ:33.5(C-1),26.7 (C-2),73.5 (C-3),52.5 (C-4),45.5 (C-5),22.3 (C-6),35.2 (C-7),42.3 (C-8),51.5 (C-9),38.0(C-10),21.6 (C-11),26.6 (C-12),39.1 (C-13),43.5(C-14),30.7 (C-15),33.3 (C-16),57.1 (C-17),50.2(C-18),48.3 (C-19),151.8 (C-20),31.7 (C-21),38.1(C-22),180.0 (C-23),18.5 (C-24),17.2 (C-25),17.2(C-26),15.3 (C-27),179.3 (C-28),110.4 (C-29),19.9(C-30)。上述数据与文献数据对照基本一致[13]，故鉴定化合物5 为3α-羟基羽扇豆-20(29)-烯-23,28-二酸。

4 人骨肉瘤143B 细胞体外细胞毒活性筛选

采用MTT 法，对化合物1 进行人骨肉瘤143B细胞体外细胞毒活性筛选。143B 细胞用含有10%胎牛血清的DMEM 培养基，以对数期细胞5×103个/孔的密度接种于96 孔板，正常培养48 h 后，加入受试药物，于加药72 h 后用酶标仪在570 nm 测定吸光度（A）值。重复实验3 次，用SPSS 20.0 软件计算半数抑制浓度（IC50）。结果显示，化合物1对143B 细胞无显著细胞毒活性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突