舒肝解郁胶囊联合莫沙必利对功能性消化不良大鼠胃黏膜CRF、C-KIT表达的影响

包瑞玲 ，刘文滨 ，丁瑞峰，黎 敏，赵丽红，段姝婷，张 玲

（1.内蒙古科技大学包头医学院，内蒙古包头 014000；2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院中医科，内蒙古包头 014010；3.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院消化科，内蒙古包头 014010；4.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院心功能科，内蒙古包头 014010）

消化不良是临床上最常见的症状之一，在众多的患者中，仅有较少的消化不良患者存在器质性损害，大多数患者考虑为功能性消化不良。功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）被定义为来自胃和十二指肠区域的临床症状，多表现为恶心、呕吐、餐后饱胀感、上腹痛等症状，并且排除可以解释这些症状的器质性改变及代谢性异常。FD 全球的发病率为11.5%～29.2%，亚洲地区约为8%～23%［1］。而且FD 患者常常伴随有抑郁、焦虑及躯体化障碍等精神心理障碍，存在异常的人格特征，多有负性生活事件和生活应激事件的经历。部分学者研究发现舒肝解郁胶囊联合莫沙必利片可有效改善FD 患者临床症状，本实验通过建立FD 大鼠模型，予以舒肝解郁胶囊联合莫沙必利片干预，观察其对大鼠体质量、胃残留率、胃黏膜促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）及干细胞因子受体（C-KIT）表达的影响。

1 材料

1.1 动物 30 只健康雄性Wistar 大鼠，由内蒙古医科大学实验动物中心提供［许可证号SCXK（蒙）2015-0001］，体质量（160±20）g；动物房温度22～24 ℃。

1.2 药物与试剂 舒肝解郁胶囊（四川济生堂药业有限公司生产，批号Z20174037，0.36 g／粒）；枸橼酸莫沙必利分散片（鲁南制药有限公司生产，批号H20031110，5 mg／片）；CRF 抗体（英国abcam 公司，货号ab8901）；C-KIT 抗体（南昌英俊科技开发有限公司，货号AF4701）。

2 方法

2.1 造模与分组 夹尾刺激+不规律饲养法［2］造模。30 只Wistar 雄性大鼠适应性饲养7 d，随机分为空白组、模型组、舒肝解郁+莫沙必利组，每组10 只。空白组不加任何干预，自然饲养，其余各组依照上述造模方法处理，造模1 周。造模结束后，空白组、模型组每只大鼠以生理盐水1 mL／100 g 灌胃；舒肝解郁+莫沙必利组以莫沙必利1.37 mg／kg、1 mL／100 g 灌胃；舒肝解郁胶囊以15 mg／mL、1 mL／100 g 灌胃，大鼠与人临床用药剂量、体型系数公式［dB＝dA×RB／RA×（WA／WB）／3］）分别配制悬浊液。每周测量大鼠体质量，根据体质量变化调整用药剂量。

2.2 体质量 记录造模期间大鼠体质量变化。

2.3 胃残留率测定实验第21 天，各组大鼠禁食不禁水24 h，每只大鼠予1 mL／100 g 营养半固体米糊（10 g 羧甲基纤维素钠、16 g 奶粉、8 g 糖、8 g 淀粉及250 mL 蒸馏水共同配制）灌胃，40 min 后予20% 乌拉坦（1 mL／100 g）腹腔麻醉后进行开腹，将大鼠肠胃分离，结扎贲门和幽门取胃，滤纸吸干水分称胃全重（m1），沿胃大弯侧剪开，去除胃内容物，PBS 缓释液清洗胃，滤纸吸干，称得胃净重（m2），胃内残留物质量占营养半固体米糊质量的百分比为胃残留率，测胃残留率＝ ［（m1-m2）／营养半固体米糊质量］×100%。

2.4 观察各组大鼠胃黏膜CRF、C-KIT 的表达情况

2.4.1 Western blot 距幽门0.5 cm 处取2 块胃窦壁组织（1 cm×1 cm），分别装入4%甲醛容器及冻存管中保存，将冻存管迅速放置液氮罐中等待检测。将组织从液氮中取出，裂解提取蛋白，BCA 法测定蛋白浓度、制胶及上样、电泳、蛋白质电转移和膜封闭、抗原抗体反应、显影、漂洗、定影、最后清水冲洗晾干保存、扫描，用IPP 软件对扫描图象的目的条带进行灰度分析。

2.4.2 免疫组化 取材，固定，脱水浸蜡，包埋，切片，捞片，烤片，微波炉抗原修复—滴加5% BSA 封闭液，室温20 min；滴加适当稀释的一抗，4 ℃过夜，PBS（pH 7.4）洗3 次，2 min／次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，室温20 min，PBS 洗；滴加试剂SABC，室温20 min，PBS 洗4 次，5 min／次；DAB 显色，苏木素轻度复染，在通风橱中晾干后，中性树胶封片—显微拍照。每张切片选择互不重叠的视野在显微镜下观察，测定单位面积的阳性细胞数表达（平均光密度），代表其表达情况。具有临床病理工作5 年以上经验的两名病理医生阅片。

2.5 统计学分析 所有数据均使用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析，首先进行方差齐性、正态分布检验，计量资料以（）表示，多组间比较选用单因素方差分析，方差齐时选用LSD 检验，方差不齐时选用非参数cruskalwallis 检验；P＜0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠体质量变化值及胃残留率 与空白组比较，模型组体质量下降（P＜0.05），与模型组比较，舒肝解郁+莫沙必利组体质量上升（P＜0.05），见表1；与空白组比较，模型组胃残留率升高（P＜0.05），提示模型组胃动力减弱；与模型组比较，舒肝解郁+莫沙必利组胃残留率下降（P＜0.05），见表2，符合FD 大鼠模型。

表1 各组大鼠体质量差值比较（g，，n＝10）

表1 各组大鼠体质量差值比较（g，，n＝10）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

表2 各组大鼠胃残留率比较（%，，n＝10）

表2 各组大鼠胃残留率比较（%，，n＝10）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

3.2 胃黏膜CRF 表达情况 与空白组比较，模型组、舒肝解郁+莫沙必利组胃CRF 表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，舒肝解郁+莫沙必利组胃CRF 的表达降低（P＜0.05），见表3～4、图1。

表3 Western blot 检测各组大鼠胃CRF 表达（%，，n＝10）

表3 Western blot 检测各组大鼠胃CRF 表达（%，，n＝10）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

3.3 胃黏膜C-KIT 表达情况 与空白组比较，模型组、舒肝解郁+莫沙必利组胃C-KIT 表达降低（P ＜0.05）；与模型组比较，舒肝解郁+莫沙必利组胃C-KIT 的表达升高（P＜0.05），见表5～6、图2。

表4 免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜CRF 表达比较（μm，，n＝10）

表4 免疫组化法检测各组大鼠胃黏膜CRF 表达比较（μm，，n＝10）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

表5 Western blot 检测各组大鼠胃C-KIT 的表达（%，，n＝10）

表5 Western blot 检测各组大鼠胃C-KIT 的表达（%，，n＝10）

注：与空白组比较，∗P ＜0.05；与模型组比较，▲P ＜0.05。

图1 Western blot 检测各组大鼠胃窦组织CRF 蛋白表达

表6 免疫组化法检测各组大鼠胃C-KIT 的表达（μm，，n＝10）

表6 免疫组化法检测各组大鼠胃C-KIT 的表达（μm，，n＝10）

注：与空白组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，▲P＜0.05。

图2 Western blot 检测各组大鼠胃窦组织C-KIT 蛋白表达

4 讨论

FD 是多种因素参与的疾病，其中胃十二指肠动力异常、内脏高敏感、精神因素是其公认的发病机制［3］。目前部分学者将舒肝解郁胶囊联合莫沙必利用于功能性胃肠病治疗中。舒肝解郁胶囊由刺五加及贯叶金丝桃组成，贯叶金丝桃是目前国内外报道最多、作用机制最明确的抗抑郁单方中药，主要用于轻中度抑郁患者的治疗［4-6］。莫沙必利为选择性5-HT4受体激动剂，通过兴奋胃肠道胆碱能中间神经元及肌间神经丛5-HT4受体，促进乙酰胆碱释放，增加胃蠕动，促进胃排空。舒肝解郁胶囊联合莫沙必利可有效改善FD 患者临床症状，降低复发率［7-8］。本实验应用夹尾及不规律饮食法制备FD 大鼠模型，模型组大鼠体质量下降，胃残留率增加。应用舒肝解郁胶囊联合莫沙必利治疗，FD 大鼠体质量增加，胃残留率下降，有效改善FD 大鼠病症。

内脏高敏感是导致FD 发生的重要发病机制之一。研究显示约34%～64% FD 患者存在对胃扩张的高敏感［9-12］。Caldarella 等［13］研究发现FD 患者不仅对胃底扩张的敏感性增强，而且对胃窦扩张呈现出高敏状态。而在应激反应中CRF 起着举足轻重的作用，CRF 是一种重要的神经内分泌肽，主要分布于中枢神经系统中与应激反应相关的区域，也存在于如胃肠道等外周区域。CRF 通过迷走中枢及外周途径参与了胃肠道应激反应过程［14］，可抑制副交感神经和提高交感神经活动，是调解下丘脑-垂体-肾上腺皮质系统的关键。在慢性应激小鼠中CRF 含量增高，经治疗后CRF浓度降低，胃排空率增加，从而减弱内脏敏感性［15-16］。FD大鼠胃CRF 阳性细胞表达数较空白组增高。予以舒肝解郁胶囊联合莫沙必利片治疗后，胃CRF 阳性细胞数及WB 表达明显下降。舒肝解郁胶囊联合莫沙必利对FD 大鼠病症治疗效果明显，其作用机制可能是通过下调胃CRF 的表达，减弱内脏高敏感相关。

Cajal 间质细胞（ICC）作为胃肠道的慢性起搏细胞，分布在胃肠道的各个部位，越来越多的研究表明，Cajal 间质细胞的减少可导致胃肠道动力障碍［17-18］。而几乎所有ICC 都特异性表达C-KIT 受体［19］，C-KIT 受体又称干细胞因子受体，干细胞因子（SCF）与C-KIT 通过胞外结构域1～3 区结合后激活一系列的信号分子，从而调节ICC 的增值、分化、发育和结构的完整性［20-21］，C-KIT 的表达下降可导致ICC 表型转化异常，失去相应的功能［22］。本实验表明舒肝解郁胶囊联合莫沙必利片可上调C-KIT 的表达，改善胃动力，促进胃排空，达到治疗功能性消化不良的目的。也有研究发现C-KIT 的过度激活导致ICC 发生变化可能是胃肠道内脏敏化发生的重要的基础［23-25］。本实验验证舒肝解郁胶囊联合莫沙必利对功能性消化不良病症具有明显治疗意义，以期为舒肝解郁胶囊的临床应用提供理论依据。